Introdução: A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e refletância total atenuada (ATR-FTIR) é uma técnica utilizada para analisar alterações bioquímicas em amostras biológicas. Entretanto, são necessários métodos quimiométricos e uso de ferramentas de inteligência artificial (IA) para análise desses dados. Objetivo: Investigar se o ATR-FTIR pode ser usado para caracterizar e distinguir o perfil bioquímico de atletas antes e após um teste de ciclismo. Métodos: Estudo transversal com 10 ciclistas realizando um teste contra o relógio de 20 km. Resultados: Os dados do ATR-FTIR, combinado com abordagens de reconhecimento de padrões, permitiram identificar diferenças bioquímicas entre os momentos pré e pós-teste. Após remoção de duas amostras outliers, análise de componentes principais (PCA) revelou uma separação distinta de pré e pós-teste a partir da região espectral fingerprint (1800 – 900 cm-1). A análise com amostragem pelo método de Monte Carlo associado ao algoritmo genético e análise discriminante (MC-GA-LDA) identificou regiões espectrais específicas relacionadas a essas diferenças, indicando as variações bioquímicas mais relevantes (bandas de 1338-1308, estiramento C-H assimétrico – amida III; e 1125-1108, estiramento assimétrico C-O-lactato). Esses resultados demonstram a sensibilidade do ATR-FTIR em detectar alterações metabólicas e sugerem sua aplicabilidade como ferramenta para monitorar respostas fisiológicas em atividades esportivas. A técnica pode ser útil no acompanhamento personalizado da carga de treinamento e identificação de marcadores específicos de desempenho, fadiga ou estresse fisiológico. Conclusão: A técnica espectroscópica ATR-FTIR, associada à quimiometria, pode ser uma abordagem promissora para caracterizar e distinguir o perfil bioquímico de atletas em resposta a estímulos físicos.