Anomalies in constitutive calcium entry (CCE) have been commonly attributed to cell dysfunction in pathological conditions such as cancer. Calcium influxes of this type rely on channels, such as transient receptor potential (TRP) channels, to be constitutively opened and strongly depend on membrane potential and a calcium driving force. We developed an optogenetic approach based on the expression of the halorhodopsin chloride pump to study CCE in non-excitable cells. Using C2C12 cells, we found that halorhodopsin can be used to achieve a finely tuned control of membrane polarization. Escalating the membrane polarization by incremental changes in light led to a concomitant increase in CCE through transient receptor potential vanilloid 2 (TRPV2) channels. Moreover, light-induced calcium entry through TRPV2 channels promoted cell migration. Our study shows for the first time that by modulating CCE and related physiological responses, such as cell motility, halorhodopsin serves as a potentially powerful tool that could open new avenues for the study of CCE and associated cellular behaviors.

Le calcium est un second messager qui participe à de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la migration, la différenciation, l’apoptose et la transmission de messagers neuronaux. Dans le modèle musculaire squelettique, le calcium est un acteur important dans le processus du couplage excitation-contraction. Il est également impliqué dans la myogenèse et dans les processus de réparation. Une dérégulation du calcium dans les cellules musculaires participe à leur dégénérescence comme il a été observé dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif de cette thèse a été par des approches innovantes d’optogénétique, d’explorer et de moduler des mécanismes fondamentaux dépendants du calcium tels que la migration, la fusion, la différenciation et la contraction dans différents modèles musculaires. 1- Dans un premier temps, l’effet de la stimulation de l’halorhodopsine (eNpHR) sur le contrôle du potentiel de membrane et sur le processus de migration de myoblastes C2C12 a été étudié. La transfection de eNpHR3.0 dans des myoblastes C2C12 a permis de générer des courants sortants diminuant le potentiel de membrane vers des valeurs stabilisées tout le long de la stimulation. Cette polarisation membranaire induit des élévations transitoires de calcium cytosolique, dépendant du canal TRPV2 localisé à la membrane plasmique. Après avoir démontré l’implication de TRPV2 dans les processus migratoires des myoblastes, les entrées de calcium induites par la stimulation lumineuse ont permis d’augmenter la migration TRPV2-dépendante des myoblastes C2C12. 2- Dans un second temps, l’impact de la stimulation par le canal rhodopsine 2 (ChR2) a été évalué pour le contrôle de l’activité calcique et sur les processus de différenciation dans des cultures primaires de myotubes murins. Après avoir caractérisé la signature calcique des cultures primaires de myotubes en différenciation avec la protéine fluorescente sensible au calcium GCaMP, un protocole de simulation optique a été développé pour reproduire la signature calcique spontanée de myotubes différenciés. En premier lieu, le contrôle de l’activité calcique par la stimulation optique de ChR2 a été confirmé au niveau d’une cellule unique ainsi qu’à l’échelle d’une culture entière. Par la suite, l’application d’un protocole de stimulation optique en culture pendant la différenciation a permis de moduler les processus de différenciation tels que la fusion et la contraction des myotubes primaires. 3- La signature calcique de cellules dystrophiques représentatives de la DMD a été explorée dans deux modèles cellulaires différents composés de cultures primaires isolées de souris mdx et de cellules musculaires humaines dérivés d’hiPSCs provenant de patients DMD. Des dérégulations de la signature calcique ont été observées dans ces deux modèles dystrophiques. Une exploration fonctionnelle a été réalisée sur les cellules musculaires dérivées d’hiPSCs au travers de stimulations électriques, pharmacologiques et optiques démontrant leur capacité à développer un phénotype musculaire et confirmant leur intérêt potentiel pour la modélisation de maladies telles que la DMD.Ces travaux ouvrent des perspectives sur l’utilisation de l’optogénétique pour évaluer la fonctionnalité des cellules et pour moduler certains processus cellulaires pour de futures applications thérapeutiques.