TP53 mutations are found in 10% to 15% of myeloid neoplasms and are associated with a dismal prognosis. Although hypomethylating agents (HMAs), such as decitabine, are active in TP53-mutated myeloid neoplasms (TP53-MN), mutation clearance is rarely complete and nearly all patients relapse. Molecular determinants of response to HMAs in TP53-MN are poorly understood. Here, we show that decitabine induces replicative stress with decreased replication fork progression, induction of single-strand DNA breaks, and activation of the ataxia telangiectasia mutated–Rad3-related (ATR) pathway. Resolution of decitabine-induced replication stress is impaired in TP53-mutated acute myeloid leukemia (AML) cells, representing a potential therapeutic vulnerability. Indeed, the combination of decitabine and ATR inhibition (ATRi) induces synthetic lethality that is selective for TP53-AML and due, in part, to induction of mitotic catastrophe. Interestingly, this synergistic lethality was not observed with azacitidine or treatment with GSK3685032, a potent DNA methyltransferase 1 inhibitor, both of which produce a comparable level of global hypomethylation to decitabine. Treatment with decitabine and an ATR inhibitor reduces leukemia burden and prolongs survival in in vivo mouse models of TP53-mutated AML. Collectively, these findings show that TP53 loss generates a selective vulnerability to decitabine-induced replication stress, with the combination of ATRi and decitabine showing promise as a new therapeutic approach for TP53-MN.

BRCA1 deficiency is observed in approximately 25% of triple-negative breast cancer (TNBC). BRCA1, a key player of homologous recombination repair, is also involved in stalled DNA replication fork protection and repair. Here, we investigated the sensitivity of BRCA1-deficient TNBC models to the frequently used replication chain terminator gemcitabine, which does not directly induce DNA breaks. A large fraction of BRCA1-deficient cells was sensitive to gemcitabine, in contrast to their isogenic BRCA1-proficient counterparts. Gemcitabine-treated BRCA1-deficient cells accumulated massive levels of ssDNA and presented no RPA or RAD51 nuclear foci. The gemcitabine-induced accumulation of ssDNA in BRCA1-deficient cells was strongly diminished by targeting MRE11 with inhibitors and by siRNA attenuation. In contrast, treatment with the PARP1/2 inhibitor olaparib did not result in MRE11-dependent over-resection. Furthermore, a fraction of gemcitabine-treated BRCA1-deficient cells that showed massive ssDNA accumulation slipped into mitosis, producing mitotic bridges and strongly stained bromodeoxyuridine (BrdU) and γH2AX micronuclei. The BrdU-positive micronuclei and DNA bridges also stained positively for cyclic GMP–AMP synthase. In conclusion, these data suggest that gemcitabine treatment in BRCA1-deficient TNBC exposes unprotected nascent DNA linked to replication fork reversal, which leads to MRE11 over-resection and ssDNA accumulation. Therefore, the observed hypersensitivity to gemcitabine indicates that it could be a beneficial addition to BRCA1-deficient TNBC treatment. Significance: Treating BRCA1-deficient triple-negative breast cancer with gemcitabine induces massive ssDNA production due to MRE11 over-resection and causes cells to slip into mitosis, produce micronuclei, accumulate DNA breaks, and ultimately die.

Environ 15 % des cancers du sein triple négatif (TNBC) sont déficients en BRCA et présentent un déficit de réparation de l'ADN par recombinaison homologue (HRD) et une sensibilité accrue aux traitements génotoxiques. Nous avons émis l'hypothèse que les TNBC BRCA-déficients sont très sensibles aux médicaments induisant un stress réplicatif, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. Nos résultats montrent que les TNBC déficients en BRCA1 (BRCA1-Def), ainsi que les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire BRCA1-Def, ont montrés une sensibilité accrue à la gemcitabine. De manière notable, la gemcitabine a induit une augmentation de la mort cellulaire dans les cellules BRCA1-Def, associée à une gestion perturbée du stress réplicatif. En effet, jusqu'à 80 % des cellules BRCA1-Def présentaient un marquage ɣH2AX persistant même 48 h après le lavage de la gemcitabine, par rapport à leur homologue de lignée BRCA1-WT dans laquelle le marquage diminue considérablement. De plus, les cellules BRCA1-Def traitées à la gemcitabine ont montré un déséquilibre persistant entre les cellules RPA32-positives et ɣH2Ax-positives, suggérant un stress réplicatif non résolu dans ces cellules et la survenue d'une catastrophe réplicative dans une fraction substantielle des cellules. En outre, une fraction importante de cellules ɣH2AX+ présentait un marquage pannucléaire, dont le nombre augmentait régulièrement au fil du temps dans les cellules BRCA1-Def traitées à la gemcitabine, alors qu'il diminuait dans les cellules BRCA1-WT. Fait intéressant, près de 90% des cellules pannucléaires ɣH2AX étaient complètement négatives pour RPA32 et présentaient un fort marquage BrdU dans des conditions non dénaturantes, indiquant une accumulation importante d'ADN simple brin spécifiquement dans ces cellules. De manière notable, un nombre important de cellules ɣH2Ax pannucléaire étaient également négatives pour les foyers RAD51, mais étaient positives pour les foyers 53BP1 et FANCD2. Le paysage opposé a été observé dans les cellules BRCA1-WT dans lesquelles les cellules ɣH2AX pannucléaires étaient RAD51+, 53BP1- et FANCD2-. Ces résultats indiquent une réponse aiguë au stress réplicatif dans le contexte BRCA1-Def qui induit l'arrêt des fourches de réplication. Cela pourrait conduire à un effondrement de la fourche de réplication et éventuellement à des ruptures massives d'ADN double brin (DSB). Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé des expériences d'électrophorèse en champ pulsé qui ont clairement montré une accumulation importante de DSB dans les cellules BRCA1-Def 48h après le lavage de gemcitabine. Ces DSB ne résultaient pas du clivage apoptotique de l'ADN car le traitement conjoint avec la gemcitabine et l'inhibiteur de l'apoptose Z-VAD FMK n'a pas modifié le niveau de DSB, suggérant que les DSB résultaient d'une accumulation d'ADNsb non protégé. Ensuite, nous avons testé si l'accumulation d'ADNsb résultait d'une surrésection causée par une activité incontrôlée de l'exonucléase MRE11 dans la cellule BRCA-Def et avons appliqué un traitement conjoint de gemcitabine et Mirin. En fait, l'inhibition de MRE11 avec Mirin a entraîné une diminution spécifique du nombre de cellules présentant la coloration ɣH2AX pannucléaire. Enfin, nous avons noté que les cellules BRCA1-Def étaient sujettes à des glissements mitotiques conduisant à des catastrophes mitotiques illustrées par une accumulation importante de mitoses aberrantes et de micronoyaux dans ces lignées. De manière notable, les micro-noyaux ont montré une double coloration positive BrdU et ɣH2AX pannucléaire indiquant qu'ils correspondaient à la fragmentation des noyaux avec un niveau important d’ADNsb. Nous avons également pu montrer que l'hypersensibilité des cancers BRCA1-Def au stress réplicatif aigu est reproductible in vivo dans des modèles PDX, dont les coupes de tissus montraient un profil de marquage ɣH2AX pannucléaire, en corrélation avec leur statut de réponse à la gemcitabine

BRCA1 deficiency is observed in approximately 25% of triple-negative breast cancer (TNBC). BRCA1, a key player of homologous recombination repair, is also involved in stalled DNA replication fork protection and repair. Here, we investigated the sensitivity of BRCA1-deficient TNBC models to the frequently used replication chain terminator gemcitabine, which does not directly induce DNA breaks. A large fraction of BRCA1-deficient cells was sensitive to gemcitabine, in contrast to their isogenic BRCA1-proficient counterparts. Gemcitabine-treated BRCA1-deficient cells accumulated massive levels of ssDNA and presented no RPA or RAD51 nuclear foci. The gemcitabine-induced accumulation of ssDNA in BRCA1-deficient cells was strongly diminished by targeting MRE11 with inhibitors and by siRNA attenuation. In contrast, treatment with the PARP1/2 inhibitor olaparib did not result in MRE11-dependent over-resection. Furthermore, a fraction of gemcitabine-treated BRCA1-deficient cells that showed massive ssDNA accumulation slipped into mitosis, producing mitotic bridges and strongly stained bromodeoxyuridine (BrdU) and γH2AX micronuclei. The BrdU-positive micronuclei and DNA bridges also stained positively for cyclic GMP–AMP synthase. In conclusion, these data suggest that gemcitabine treatment in BRCA1-deficient TNBC exposes unprotected nascent DNA linked to replication fork reversal, which leads to MRE11 over-resection and ssDNA accumulation. Therefore, the observed hypersensitivity to gemcitabine indicates that it could be a beneficial addition to BRCA1-deficient TNBC treatment.Significance:Treating BRCA1-deficient triple-negative breast cancer with gemcitabine induces massive ssDNA production due to MRE11 over-resection and causes cells to slip into mitosis, produce micronuclei, accumulate DNA breaks, and ultimately die.