Three-dimensional cell culture has revolutionized cellular biology research and opened the door to novel discoveries in terms of cellular behavior and response to microenvironment stimuli. Different types of 3D culture exist today, including hydrogel scaffold-based models, which possess a complex structure mimicking the extracellular matrix. These hydrogels can be made of polymers (natural or synthetic) or low-molecular weight gelators that, via the supramolecular assembly of molecules, allow the production of a reproducible hydrogel with tunable mechanical properties. When cancer cells are grown in this type of hydrogel, they develop into multicellular tumor spheroids (MCTS). Three-dimensional (3D) cancer culture combined with a complex microenvironment that consists of a platform to study tumor development and also to assess the toxicity of physico-chemical entities such as ions, molecules or particles. With the emergence of nanoparticles of different origins and natures, implementing a reproducible in vitro model that consists of a bio-indicator for nano-toxicity assays is inevitable. However, the maneuver process of such a bio-indicator requires the implementation of a repeatable system that undergoes an exhaustive follow-up. Hence, the biggest challenge in this matter is the reproducibility of the MCTS and the associated full-scale characterization of this system’s components.

For the last few decades, many efforts have been made in developing cell culture methods in order to overcome the biological limitations of the conventional two-dimensional culture. This paradigm shift is driven by a large amount of new hydrogel-based systems for three-dimensional culture, among other systems, since they are known to mimic some living tissue properties. One class of hydrogel precursors has received interest in the field of biomaterials, low-molecular-weight gelators (LMWGs). In comparison to polymer gels, LMWG gels are formed by weak interactions upon an external trigger between the molecular subunits, giving them the ability to reverse the gelation, thus showing potential for many applications of practical interest. This study presents the use of the nucleoside derivative subclass of LMWGs, which are glyco-nucleo-bola-amphiphiles, as a proof of concept of a 3D cell culture scaffold. Physicochemical characterization was performed in order to reach the optimal features to fulfill the requirements of the cell culture microenvironment, in terms of the mechanical properties, architecture, molecular diffusion, porosity, and experimental practicality. The retained conditions were tested by culturing glioblastoma cells for over a month. The cell viability, proliferation, and spatial organization showed during the experiments demonstrate the proof of concept of nucleoside-derived LMWGs as a soft 3D cell culture scaffold. One of the hydrogels tested permits cell proliferation and spheroidal organization over the entire culture time. These systems offer many advantages as they consume very few matters within the optimal range of viscoelasticity for cell culture, and the thermoreversibility of these hydrogels permits their use with few instruments. The LMWG-based scaffold for the 3D cell culture presented in this study unlocked the ability to grow spheroids from patient cells to reach personalized therapies by dramatically reducing the variability of the lattice used.

Three-dimensional (3D) cancer models, such as multicellular tumor spheroids (MCTS), are biological supports used for research in oncology, drug development and nanotoxicity assays. However, due to various analytical and biological challenges, the main recurring problem faced when developing this type of 3D model is the lack of reproducibility. When using a 3D support to assess the effect of biologics, small molecules or nanoparticles, it is essential that the support remains constant over time and multiples productions. This constancy ensures that any effect observed following molecule exposure can be attributed to the molecule itself and not to the heterogeneous properties of the 3D support. In this study, we address these analytical challenges by evaluating for the first time the 3D culture of a sub-population of cancer stem cells (CSCs) from a glioblastoma cancer cell line (U87-MG), produced by a SdFFF (sedimentation field-flow fractionation) cell sorting, in a supramolecular hydrogel composed of single, well-defined molecule (bis-amide bola amphiphile 0.25% w/v) with a stiffness of 0.4 kPa. CSCs were chosen for their ability of self-renewal and multipotency that allow them to generate fully-grown tumors from a small number of cells. The results demonstrate that CSCs cultured in the hydrogel formed spheroids with a mean diameter of 336.67 ± 38.70 µm by Day 35, indicating reproducible growth kinetics. This uniformity is in contrast with spheroids derived from unsorted cells, which displayed a more heterogeneous growth pattern, with a mean diameter of 203.20 ± 102.93 µm by Day 35. Statistical analysis using an unpaired t-test with unequal variances confirmed that this difference in spheroid size is significant, with a p-value of 0.0417 (p < 0.05). These findings demonstrate that CSC-derived spheroids, when cultured in a well-defined hydrogel, exhibit highly reproducible growth patterns compared to spheroids derived from unsorted cells, making them a more reliable 3D model for biological research and drug testing applications.

Face à l'écart croissant observé entre la culture cellulaire conventionnelle en 2D et les essais cliniques, les chercheurs se sont résolus à utiliser des modèles animaux afin d'obtenir des résultats plus pertinents. Cependant, les modèles in vivo présentent de nombreuses controverses éthiques et sont coûteux et longs à mettre en œuvre. Par conséquent, la culture tridimensionnelle est apparue comme une solution intermédiaire, comprenant un réseau complexe dans lequel les cellules se développent d'une manière semblable à la physiologie. Dans ce projet de thèse, nous nous sommes concentrés sur la maîtrise d'une série d'études en vue de construire un système 3D reproductible basé sur des sphéroïdes tumoraux multicellulaires. Ces études impliquent, d'une part, la conception d'une nouvelle matrice 3D à base d'hydrogel supramoléculaire, avec des propriétés physico-chimiques définies et adaptées à la lignée cellulaire d'intérêt. Et d'autre part, la culture 3D inédite d'une population de cellules souches cancéreuses. Grâce à leurs caractéristiques intrinsèques uniques d'auto-renouvellement et de multipotence, les cellules souches cancéreuses permettent de générer des sphéroïdes reproductibles présentant des caractéristiques biologiques similaires à la tumeur d'origine. Compte tenu des faibles proportions de CSC en culture cellulaire, nous avons orienté cette recherche vers une lignée cellulaire de Glioblastome (U87-MG) qui est un cancer très hétérogène et qui présente un taux élevé de CSC par rapport aux autres lignées. Après un criblage de différents molécules gélifiantes de faible poids moléculaire, un hydrogel de glycosyl-nucléoside-bolaamphiphile a été choisi pour la culture 3D. La nature chimique et la concentration de cet hydrogel a été réajustée pour atteindre une viscoélasticité similaire à celle du microenvironnement cérébral, adaptée aux cellules de Glioblastome. Simultanément, les cellules souches cancéreuses ont été isolées de la population hétérogène à l'aide d'une méthode de fractionnement par couplage flux-force de sédimentation qui est bien adaptée et définie pour le tri des cellules de Glioblastome. Ensemble, ces deux éléments essentiels nous a permis de proposer un modus operandi maîtrisé qui permet d'établir une plateforme de sphéroïdes tumoraux reproductibles disponible pour une variété de tests (thérapeutiques, tumorigènes, de toxicité, etc.). L'émergence de nanoparticules dans l’environnement en raison de leur utilisation croissante constitue un problème majeur en santé publique. Notre plateforme 3D présente des propriétés potentiellement adaptées pour évaluer leur impact sur des systèmes vivants. Par conséquent, nous présentons dans ce projet une étude préliminaire de cette plateforme comme bioindicateur pour l'évaluation de la toxicité des nanoparticules d'argent manufacturées. Cette preuve de concept a été réalisée en suivant une méthodologie spécifique : 1) la conception et la caractérisation biologique du système 3D, 2) la caractérisation physico-chimique des nanoparticules d'argent, 3) l'évaluation de l'impact des nanoparticules sur la culture cellulaire 2D et 4) l'évaluation de l'impact sur la culture cellulaire 3D. L'écart entre les résultats obtenus en culture 2D et 3D souligne l'importance des modèles 3D dans les tests de toxicité.