Probiotic microorganisms are currently considered as a promising platform for the development of recombinant vaccines expressing foreign antigens. In this study, we generated and evaluated the live mucosal recombinant vaccine by integrating genes encoding influenza virus neuraminidase (NA) of the N2 subtype into the DNA of the probiotic strain Enterococcus faecium L3 (L3). We confirmed NA expression in the pili of L3 using immune electron microscopy. Mice were fed with a probiotic vaccine containing the NA gene (L3-NA) or pure L3. Oral administration of L3-NA caused detectable increase in virus-specific serum IgG and local IgA after the third feeding. Immunization with L3-NA increased the survival rate by 34% when the mice were infected using A(H1N1)pdm09 influenza virus after the third feeding. After S. pneumoniae post-influenza infection, the L3-NA-immunized mice were 50% more protected from lethality in comparison with L3-fed mice. Thus, a live probiotic vaccine candidate based on L3 induced the formation of systemic and local immunity and provide partial protection against complicated influenza.

Influenza and S. pneumoniae infections are a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Intranasal live influenza vaccine (LAIV) may prevent influenza-related bacterial complications. The objectives of the study are to estimate resistance against early influenza infection and post-influenza pneumococcal pneumonia after LAIV in mice. Mice were administered intranasally the monovalent LAIV A/17/Mallard Netherlands/00/95(H7N3), A/17/South Africa/2013/01(H1N1)pdm09 or trivalent LAIV 2017–2018 years of formulation containing A/17/New York/15/5364(H1N1)pdm09 vaccine strain. LAIV demonstrated early protection against homologous and heterologous infections with A/South Africa/3626/2013 (H1N1) pdm09 influenza virus on day six, following immunization. Following boost immunization, trivalent LAIV demonstrated a pronounced protective effect both in terms of lethality and pneumococcal lung infection when S. pneumoniae infection was performed three days after the onset of influenza infection. Conclusion: LAIV provides early protection against homologous and heterologous viral infections and has a protective effect against post-influenza pneumococcal infection. These data suggest that the intranasal administration of LAIV may be useful during the cycle of circulation not only of influenza viruses, but also of other causative agents of acute respiratory infections.

Influenza outbreaks caused by A/H7N9 viruses have occurred since 2013. After 2016, A/H7N9 influenza viruses underwent evolutionary changes. In this study, we examined the antigenic properties of influenza neuraminidase (NA) of A/H7N9 viruses as part of a live influenza vaccine (LAIV). It was shown that neuraminidase inhibiting (NI) antibodies obtained after A/Anhui/1/2013(H7N9)-based LAIV vaccination did not inhibit A/Hong Kong/125/2017(H7N9) NA and vice versa. The A/Hong Kong/125/2017(H7N9)-based LAIV elicited higher levels of NI antibodies compared to the A/Anhui/1/2013(H7N9)-based LAIV after two doses. Thelow degree of coincidence of the antibody response to hemagglutinin (HA) and NA after LAIV vaccination allows us to consider an enzyme-linked lectin assay (ELLA) as an additional measure for assessing the immunogenicity of influenza vaccines. In mice, N9-reactive monoclonal antibodies (mABs) for the A/environment/Shanghai/RL01/2013(H7N9) influenza virus partially protected against lung infection from the A/Guangdong/17SF003/2016 IDCDC-RG56N(H7N9) virus, thus showing the cross-protective properties of monoclonal antibodies against the drift variant.

Neuraminidase (NA)-based immunity to influenza can be useful for protecting against novel antigenic variants. To develop safe and effective tools to assess NA-based immunity, we generated a baculovirus-based pseudotyped virus, N1-Bac, that expresses the full-length NA of the influenza A/California/07/2009 (H1N1)pdm09 strain. We evaluated the level of NA-inhibiting (NI) antibodies in the paired blood sera of influenza patients by means of an enzyme-linked lectin assay (ELLA) using the influenza virus or N1-Bac. Additionally, we evaluated the level of NA antibodies by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with an N1-expressing Sf21 culture. We detected a strong correlation between our results from using the influenza virus and NA-Bac pseudoviruses to detect NI antibodies and a medium-strong correlation between NI antibodies and NA antibodies determined by an N1-cell ELISA, indicating that baculovirus-based platforms can be successfully used to evaluate NI or NA antibodies. Furthermore, animal experiments showed that immunization with N1-Bac protected against infection with a drift variant of the A/H1N1pdm09 influenza virus. Our results demonstrate that recombinant baculovirus can be an effective influenza pseudotype to evaluate influenza serologic immunity and protect against influenza virus infection.

В мире накоплено достаточно данных о необходимости усовершенствования оценки иммуногенности гриппозных вакцин. В нашей стране для определения их иммуногенности регламентирован единственный тест – постановка реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками крови вакцинированных лиц. Он далеко не полностью отражает поствакцинальные иммунные изменения в организме. Нами проведено изучение у волонтеров, ранее праймированных резервной живой гриппозной вакциной A (H5N2), иммуногенной активности инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ), приготовленной из потенциально пандемического птичьего вируса гриппа A (H5N1) NIBRG-23. Сравнивали три метода: иммуноферментный анализ (ИФА) и РТГА с сыворотками крови (сывороточные антитела), и альтернативный подход, заключающийся в тестировании в ИФА антител, секретируемых В-клетками in vitro в надосадках культур мононуклеаров периферической крови (МПК) (секретируемые антитела). Показано значительное преимущество последнего метода в выявлении количества поствакцинальных конверсий IgA- и IgG-антител на раннем сроке после первой прививки (седьмой день). Эти данные позволили полностью оценить иммуногенность ИГВ H5N1, не прибегая к данным, полученным на более поздних сроках: 28-й день после первой прививки и 28-й день после второй прививки. Вывод: испытанная методика определения в ИФА секреции антител in vitro может быть использована в качестве альтернативного теста для оценки иммуногенности гриппозных вакцин. Этот метод дает более точное представление о штаммоспецифическом гуморальном иммунном ответе.

Существует реальная угроза прорыва в человеческую популяцию зоонозных (птичьих и свиных) вирусов гриппа А. В этом случае тяжесть таких пандемий зависит от состояния иммунитета населения к этим возбудителям. В мировой литературе неоднократно декларировалось положение о полном отсутствии у людей иммунитета к данным возбудителям. Мы исследовали состояние системного, локального и Т-клеточного иммунитета взрослых людей разного возраста к потенциально пандемическим зоонозным (H3N2sw, H5N1, H5N2, H7N3 и H7N9) и антропонозному (H2N2) вирусам гриппа А. Полученные результаты свидетельствуют, что у обследованных лиц существует (i) гетеросубтипический локальный (IgA-АТ) и Т-клеточный (CD4+ и CD8+Т-клетки центральной (Tcm) и периферической (Tem) иммунологической памяти) иммунитет, но отсутствует системный иммунитет (антигемагглютинирующие и вируснейтрализующие сывороточные антитела) к птичьим вирусам гриппа А; (ii) локальный иммунитет (IgA-АТ) к циркулировавшему в 1957-1968 гг. антропонозному вирусу А (H2N2) не только у ранее праймированных лиц, но и людей, родившихся после 1968 г; (iii) полноценный системный и локальный иммунитет к потенциально пандемическому свиному вирусу А (H3N2sw). Вывод: для научно обоснованного прогноза эпидемиологической ситуации и планирования объема противоэпидемических мероприятий по потенциально пандемическим вирусам гриппа А необходим периодический мониторинг состояния коллективного иммунитета населения к этим возбудителям по всем его адаптивным параметрам. В этом плане опора только на данные молекулярно-биологического анализа возбудителей может приводить к существенным ошибкам.