Helicase proteins are known to use the energy of ATP to unwind nucleic acids and to remodel protein-nucleic acid complexes. They are involved in almost every aspect of DNA and RNA metabolisms and participate in numerous repair mechanisms that maintain cellular integrity. The archaeal Lhr-type proteins are SF2 helicases that are mostly uncharacterized. They have been proposed to be DNA helicases that act in DNA recombination and repair processes in Sulfolobales and Methanothermobacter. In Thermococcales, a protein annotated as an Lhr2 protein was found in the network of proteins involved in RNA metabolism. To investigate this, we performed in-depth phylogenomic analyses to report the classification and taxonomic distribution of Lhr-type proteins in Archaea, and to better understand their relationship with bacterial Lhr. Furthermore, with the goal of envisioning the role(s) of aLhr2 in Thermococcales cells, we deciphered the enzymatic activities of aLhr2 from Thermococcus barophilus (Tbar). We showed that Tbar-aLhr2 is a DNA/RNA helicase with a significant annealing activity that is involved in processes dependent on DNA and RNA transactions.

Helicases are proteins that use the energy of ATP to unwind nucleic acids and to remodel protein-nucleic acid complexes. They are involved in almost every aspect of the DNA and RNA metabolisms and participate in numerous repair mechanisms that maintain cellular integrity. Helicases are classified into 6 superfamilies (SF1-6). The archaeal Lhr-type proteins are SF2 helicases that are mostly uncharacterized. They have been proposed to be a DNA helicase that acts in DNA recombination and repair processes in Sulfolobales and Methanothermobacter. In parallel, a protein annotated as an Lhr2 protein was also found in the network of proteins involved in RNA metabolism in Thermococcales. To this respect, we performed in-depth phylogenomic analyses to report the classification and taxonomic distribution of Lhr-type proteins in Archaea, and to better understand their relationship with bacterial Lhr. Furthermore, with the goal of envisioning the role(s) of aLhr2 in archaeal cells, we deciphered the enzymatic activities of aLhr2 from Thermococcus barophilus (Tbar). We showed that Tbar-aLhr2 is a DNA/RNA helicase acting on DNA:RNA and RNA:RNA duplexes and proposed that aLhr2 helicases are involved in processes dependent of DNA and RNA transactions.

Etudes phylogénomiques et moléculaires des hélicases de type Lhr chez les Archaea et les bactéries: Les hélicases, classées en six superfamilles (SF1-6), sont des protéines qui utilisent l'énergie de l'ATP pour dérouler les acides nucléiques et pour remodeler les complexes protéines-acides nucléiques. Elles sont impliquées dans presque tous les aspects du métabolisme de l'ADN et de l'ARN en participant à de nombreux mécanismes de maintien de l'intégrité cellulaire. Les protéines de type Lhr sont des hélicases SF2 qui sont pour la plupart non caractérisées. Récemment, par des approches phylogénomiques, Dr H. Chamieh et ses collaborateurs ont classé toutes les hélicases SF1 et SF2 présentes dans les génomes d'Archaea et ont montré que les protéines de type Lhr sont ubiquitaires (Chamieh et al. 2016). De plus, en déterminant les réseaux d'interaction des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, comme la ribonucléase aRNase J et l'hélicase ASH-Ski2, Dr B. Clouet-d'Orval et ses collaborateurs ont identifié un lien entre les machines de traduction, de dégradation de l'ARN et de transcription chez les Thermococcales -archaea hyperthermophile- avec, au sein de ces réseaux, une protéine annotée comme une hélicase de type Lhr (Phung et al. 2020). Dans ce contexte, les travaux de ma thèse ont pour objectif d'effectuer des analyses phylogénomiques approfondies des hélicases de type Lhr chez les archées et les bactéries, de disséquer la fonction moléculaire de aLhr2 chez Thermococcus barophilus, organisme modèle pour les études biochimiques et génétiques chez les Thermococcales, et d'étudier le rôle de l'hélicase Lhr de E. coli où le gène lhr est en opéron avec le gène codant pour la RNase T. Dans une première partie, une étude bibliographique (publication d'un chapitre de livre ; Hajj et al, 2019) et des analyses phylogénomiques ont permis de définir les protéines de type Lhr comme ubiquitaire chez les archées et d'identifier cinq groupes d'orthologues. Ces analyses permettent de proposer un chemin évolutif pour les protéines Lhr d'archées et de bactéries et d'émettre des hypothèses sur leurs fonctions dans la cellule (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur l'étude moléculaire de aLhr2 de Thermococcus barophilus (Tbar). Pour étudier les activités enzymatiques de Tbar-aLhr2, le gène alhr2 a été cloné et la protéine recombinante Tbar-aLhr2 exprimée à l'aide du système d'expression pET chez E. coli. Nous avons démontré que Tbar-aLhr2 est une ATPase avec une affinité similaire pour l'ADN et l'ARN simple brin qui peut spécifiquement former et dérouler des duplex ADN/ARN avec une extrémité 3' sortante. Enfin, nous avons effectué des analyses protéomiques et transcriptomiques pour identifier le réseau de protéines associées à Tbar-aLhr2 et pour déterminer l'impact de la délétion du gène alhr2 (Δalhr2) sur l'expression génique chez T. barophilus. Au regard de ces résultats, nous proposons que Tbar-aLhr2 est impliqué au niveau de la transcription et/ou de la réparation de l'ADN chez les Thermococcales en agissant au niveau des "R-loop" (duplex ARN/ADN) (Hajj et al, Manuscrit en préparation). Dans une troisième partie, nous avons initié une étude fonctionnelle de l'hélicase bLhr de E. coli (Eco). Pour tester l'interaction entre Eco-bLhr et la RNase T qui sont exprimées au sein d'un même opéron, le gène Eco-blhr a été cloné et la protéine recombinante Eco-bLhr exprimée. La RNase T est une ribonucléase connue pour être impliquée dans la réparation de l'ADN et le métabolisme des ARNt et ARNr. Finalement, une discussion permet de comparer le(s) rôle(s) proposé(s) pour les hélicases de type Lhr chez les bactéries et les archées en dégageant l'ARN comme acteur clé dans la réparation des dommages de l'ADN.