The auxin-inducible degron (AID) system is a promising tool for dynamic protein degradation. In mammalian cells, this approach has become indispensable to study fundamental molecular functions, such as replication, chromatin dynamics, or transcription, which are otherwise difficult to dissect. We present evaluation of the two prominent AID systems based on OsTIR1 and AtAFB2 auxin receptor F-box proteins (AFBs). We analyzed degradation dynamics of cohesin/condensin complex subunits in mouse embryonic stem cells (Rad21, Smc2, Ncaph, and Ncaph2) and human haploid HAP1 line (RAD21, SMC2). Double antibiotic selection helped achieve high homozygous AID tagging of an endogenous gene for all genes using CRISPR/Cas9. We found that the main challenge for successful protein degradation is obtaining cell clones with high and stable AFB expression levels due to the mosaic expression of AFBs. AFB expression from a transgene tends to decline with passages in the absence of constant antibiotic selection, preventing epigenetic silencing of a transgene, even at the AAVS1 safe-harbor locus. Comparing two AFBs, we found that the OsTIR1 system showed weak dynamics of protein degradation. At the same time, the AtAFB2 approach was very efficient even in random integration of AFB-expressed transgenes. Other factors such as degradation dynamics and low basal depletion were also in favor of the AtAFB2 system.

В процессе развития многоклеточного организма из одной тотипотентной зиготы образуется огромное количество клеток (триллионы для человека) с разной специализацией. Во взрослом состоянии многие ткани постоянно самообновляются: старые клетки погибают, а из популяции стволовых клеток образуются новые. Изучение судьбы отдельных клеток, их происхождения и родственных связей дает ответы на многие вопросы, связанные как с нормальным развитием, так и с патогенезом. Прямые наблюдения за развивающимися эмбрионами позволили установить судьбу бластомеров асцидии Styela partita, а также происхождение всех клеток червя Caenorhabditis elegans. Исследователям повезло с объектом: в первом случае происходит естественное «маркирование » бластомеров, во втором, поскольку тело червя прозрачно, можно следить за каждой клеткой нематоды. В большинстве же случаев определение клеточных линий и идентификация субпопуляций стволовых клеток представляют большую трудность для исследователей. Поэтому для отслеживания судьбы отдельных клеток стали разрабатываться методы маркирования, основанные на внесении в клетки специфических меток, которые наследуются в ходе делений. Поскольку все потомки исходной клетки несут одинаковые метки, их можно легко отличить от потомков других клеток. В обзоре обсуждаются методы маркирования клеток с помощью красителей и генетических конструкций, обеспечивающих синтез белков-репортеров, по наличию которых можно установить родство клеток. Особое внимание уделено методам, основанным на внесении наследуемой метки в геном клеток (генетическое маркирование), в том числе вирусному маркированию и клеточному баркодированию. Один из разделов обзора посвящен маркированию клеток с помощью системы CRISPR/Cas – популярного инструмента генной инженерии.

Mechanisms that ensure repair of double-stranded DNA breaks play a key role in the integration of foreign DNA into the genome of transgenic organisms. After pronuclear microinjection, exogenous DNA is usually found in the form of concatemer consisting of multiple co-integrated transgene copies. Here we investigated contribution of various DSB repair pathways to the concatemer formation. We injected a pool of linear DNA molecules carrying unique barcodes at both ends into mouse zygotes and obtained 10 transgenic embryos with transgene copy number ranging from 1 to 300 copies. Sequencing of the barcodes allowed us to assign relative positions to the copies in concatemers and to detect recombination events that happened during integration. Cumulative analysis of approximately 1000 integrated copies revealed that more than 80% of copies underwent recombination when their linear ends were processed by SDSA or DSBR. We also observed evidence of double Holliday junction (dHJ) formation and crossing-over during the formation of concatemers. Additionally, sequencing of indels between copies showed that at least 10% of the DNA molecules introduced into the zygote are ligated by non-homologous end joining (NHEJ). Our barcoding approach documents high activity of homologous recombination after exogenous DNA injection in mouse zygote.