The replication-timing program constitutes a key element of the organization and coordination of numerous nuclear processes in eukaryotes. This program is established at a crucial moment in the cell cycle and occurs simultaneously with the organization of the genome, thus indicating the vital significance of this process. With recent technological achievements of high-throughput approaches, a very strong link has been confirmed between replication timing, transcriptional activity, the epigenetic and mutational landscape, and the 3D organization of the genome. There is also a clear relationship between replication stress, replication timing, and genomic instability, but the extent to which they are mutually linked to each other is unclear. Recent evidence has shown that replication timing is affected in cancer cells, although the cause and consequence of this effect remain unknown. However, in-depth studies remain to be performed to characterize the molecular mechanisms of replication-timing regulation and clearly identify different cis- and trans-acting factors. The results of these studies will potentially facilitate the discovery of new therapeutic pathways, particularly for personalized medicine, or new biomarkers. This review focuses on the complex relationship between replication timing, replication stress, and genomic instability.

Over the last decade, CDK4/6 inhibitors (palbociclib, ribociclib and abemaciclib) have emerged as promising anticancer drugs. Numerous studies have demonstrated that CDK4/6 inhibitors efficiently block the pRb-E2F pathway and induce cell cycle arrest in pRb-proficient cells. Based on these studies, the inhibitors have been approved by the FDA for treatment of advanced hormonal receptor (HR) positive breast cancers in combination with hormonal therapy. However, some evidence has recently shown unexpected effects of the inhibitors, underlining a need to characterize the effects of CDK4/6 inhibitors beyond pRb. Our study demonstrates how palbociclib impairs origin firing in the DNA replication process in pRb-deficient cell lines. Strikingly, despite the absence of pRb, cells treated with palbociclib synthesize less DNA while showing no cell cycle arrest. Furthermore, this CDK4/6 inhibitor treatment disturbs the temporal program of DNA replication and reduces the density of replication forks. Cells treated with palbociclib show a defect in the loading of the Pre-initiation complex (Pre-IC) proteins on chromatin, indicating a reduced initiation of DNA replication. Our findings highlight hidden effects of palbociclib on the dynamics of DNA replication and of its cytotoxic consequences on cell viability in the absence of pRb. This study provides a potential therapeutic application of palbociclib in combination with other drugs to target genomic instability in pRB-deficient cancers.

Grâce à l'action simultanée des enzymes PARP (synthèse) et PARG (dégradation), la PARylation (PAR) est une modification post-traductionnelle hautement dynamique des protéines, ce qui en fait une forme efficace de signalisation moléculaire, en particulier dans le noyau. Le recrutement de protéines, principalement via la protéine PARP1 autoPARylée, a été décrit dans la détection et la réparation des dommages à l'ADN, la compaction de la chromatine et la régulation de la transcription. Une accumulation de travaux suggère aujourd'hui que la PAR et la protéine PARP1 jouent un rôle dans le processus de réplication de l'ADN, principalement au niveau des fourches de réplication bloquées. Des travaux récents ont également montré que la dérégulation de la PAR peut affecter la réplication de l'ADN et induire une instabilité génomique. Cependant, les mécanismes moléculaires associés restent peu clairs jusqu'à présent. Les inhibiteurs de PARP (PARPi) sont actuellement utilisés pour traiter certains cancers du sein et de l'ovaire mutés BRCA1-2 en amplifiant l'instabilité génétique, ce qui entraîne la mort cellulaire. Cependant, la cause de l'instabilité induite par ces inhibiteurs reste controversée et des cas de résistance au cancer peuvent apparaître. Les inhibiteurs de PARG (PARGi) sont moins décrits mais montrent des résultats prometteurs pour le traitement du cancer. Dans ce contexte, mon projet de thèse vise à comprendre comment une dérégulation de la PAR influence la dynamique de la réplication de l'ADN en utilisant des inhibiteurs de PARP et de PARG dans des cellules humaines. En utilisant des approches moléculaires et omiques, j'ai dans un premier temps observé les PARPi et PARGi retardent la progression de la phase S, induisent un stress réplicatif, diminuent la synthèse de l'ADN et provoquent des modifications du programme temporel de la réplication de l'ADN à l'échelle du génome. J'ai ensuite cherché à comprendre les effets de ces inhibiteurs sur la réplication au niveau moléculaire. Une analyse des protéines localisées à la chromatine pendant la phase S après traitements PARPi ou PARGi a montré une diminution de certaines protéines du pré-IC, suggérant un effet de ces inhibiteurs sur l'activation des origines de réplication, et a également montré une diminution de PCNA monoubiquitinée, suggérant un impact sur la synthèse translésionnelle de l'ADN. En outre, par des expériences iPOND combinées à la spectrométrie de masse, j'ai montré que la composition du réplisome est modifiée par la dérégulation de la PAR induite par ces inhibiteurs. En particulier, j'ai observé une diminution significative des protéines FANCD2-FANCI-BRCA1-BARD1-RAD18, connues pour être impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN. Enfin, par des tests de comète en conditions alcalines ou neutres, j'ai observé une accumulation de cassures simple-brin en fin de G1 et de cassures double-brin au cours de la phase S dans des cellules traitées par PARPi ou PARGi. Notre modèle actuel est qu'une dérégulation de la PAR aurait deux effets génotoxiques dans les cellules au cours de la phase S. Premièrement, les PARPi ou PARGi entraînent une accumulation de cassures simple-brin sur l'ADN matrice, très certainement car ces cassures endogènes à notre lignée cellulaire modèle ne sont pas réparées efficacement par le SSBR lorsque la PAR est dérégulée. Ensuite, au cours de la phase S, une dérégulation de la PAR induit une diminution des protéines FANC/BRCA au sein du réplisome, ce qui pourrait altérer la protection de la fourche réplicative lors de la rencontre avec ces cassures simple-brin présentes dans l'ADN matrice. Ces deux effets combinés pourraient affecter la progression des fourches réplicatives et expliquer le stress réplicatif généré par ces inhibiteurs. Ces travaux ont permis d'apporter des connaissances supplémentaires sur les effets génotoxiques des inhibiteurs de PARP et PARG au cours de la réplication de l'ADN dans des cellules cancéreuses humaines.

Poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) is a protein modification mostly synthesised and degraded by PARP1/2 and PARG enzymes, respectively. PARylation is involved in many covalent and non-covalent protein-protein interactions in the nucleus, making it a powerful form of molecular signaling in DNA metabolism. PARP inhibitors (PARPi) have shown efficacy in the treatment of Homologous Recombination (HR)-deficient cancers, yet the full range of molecular mechanisms underlying the activity of these drugs is not fully understood. Here, we decipher the direct consequences of PARPi-induced loss of PARylation on DNA replication. First, PARPi treatment during a single S phase induces replicative stress, delays S phase progression and causes genome-wide replication timing changes of disease-associated regions. These DNA replication alterations appear to be caused by an accumulation of SSBs in the DNA replicative template when PARylation is inhibited, which then seems to lead to one-ended DSBs and fork collapse during S phase. Second, PARPi deplete FANCD2-I, BRCA, monoubiquitinated PCNA and RAD18 proteins from the replisomes. The two PARPi tested then appear to modulate the choice of fork restart mechanisms and influence replisome dynamics in different ways. Taken together, our study highlights the common and unique primary effects of two PARPi on unperturbed DNA replication in human cells. GRAPHICAL

Over the last decade, CDK4/6 inhibitors (palbociclib, ribociclib and abemaciclib) have emerged as promising anticancer drugs. Numerous studies have demonstrated that CDK4/6 inhibitors efficiently block the pRb-E2F pathway and induce cell cycle arrest in pRb-proficient cells. Based on these studies, the inhibitors have been approved by the FDA for treatment of advanced hormonal receptor (HR) positive breast cancers in combination with hormonal therapy. However, some evidence has recently shown unexpected effects of the inhibitors, promoting needs to understand more about the mechanism of inhibitors beyond pRb. Our study demonstrates here how palbociclib impairs the origin firing in the DNA replication process in pRb-deficient cell lines. Strikingly, despite the absence of pRb, cells treated with palbociclib synthesize less DNA without any induced cell cycle arrest. Furthermore, palbociclib treatment disturbs the temporal program of DNA replication and reduces the density of replication forks. Cells treated with palbociclib show a defect in the loading of proteins of the Pre-initiation complex (Pre-IC) on chromatin, indicating a reduced initiation of DNA replication. Our findings highlight hidden effects of palbociclib on the dynamics of DNA replication and on its cytotoxic consequences on cell viability in the absence of pRb. This study provides a potential therapeutic application of palbociclib to target genomic instability towards pRb deficient patients. Significance Statement Palbociclib is a promising anticancer drug for pRb-proficient cell, particularly for hormonal receptor positive breast cancer, that induces the cell cycle arrest. But what about pRb deficient cell lines ? Our results show that Palbociclib disturb the DNA replication process inducing a replicative stress, an increase of DNA damages and leading to a significant decrease in cell viability. Palbociclib impairs the DNA synthesis reducing the number of active origins with the decrease of availability of the pre-initiation complexes. We believe that the demonstration of this effect of palbociclib on pRb-deficient cells may be a new therapeutic entry point in combination with other treatments for these types of cancer. Replicative stress can be one of weaknesses of pRb defficient cancer cells.