Leishmaniaparasites possess a unique and complex cytoskeletal structure termed flagellum attachment zone (FAZ) connecting the base of the flagellum to one side of the flagellar pocket (FP), an invagination of the cell body membrane and the sole site for endocytosis and exocytosis. This structure is involved in FP architecture and cell morphogenesis, but its precise role and molecular composition remain enigmatic. Here, we characterizedLeishmaniaFAZ7, the only known FAZ protein containing a kinesin motor domain, and part of a clade of trypanosomatid-specific kinesins with unknown functions. The two paralogs of FAZ7, FAZ7A and FAZ7B, display different localizations and functions. FAZ7A localizes at the basal body, while FAZ7B localizes at the distal part of the FP, where the FAZ structure is present inLeishmania. While null mutants of FAZ7A displayed normal growth rates, the deletion of FAZ7B impaired cell growth in both promastigotes and amastigotes ofLeishmania. The kinesin activity is crucial for its function. Deletion of FAZ7B resulted in altered cell division, cell morphogenesis (including flagellum length), and FP structure and function. Furthermore, knocking out FAZ7B induced a mis-localization of two of the FAZ proteins, and disrupted the molecular organization of the FP collar, affecting the localization of its components. Loss of the kinesin FAZ7B has important consequences in the insect vector and mammalian host by reducing proliferation in the sand fly and pathogenicity in mice. Our findings reveal the pivotal role of the only FAZ kinesin as part of the factors important for a successful life cycle ofLeishmania.

In 2018, the incidence of tularemia increased twofold in the west of France, with many pneumonic forms, suggesting environmental sources of infection. We investigated the presence of Francisellatularensis subsp. holarctica and other Francisella species DNA in the natural aquatic environment of this geographic area. Two sampling campaigns, in July 2019 and January 2020, allowed the collection of 87 water samples. Using a combination of real-time PCR assays, we tested the presence of either Francisella sp., F. tularensis/F. novicida, and F. tularensis subsp. holarctica, the latter being the only tularemia agent in Europe. Among 57 water samples of the first campaign, 15 (26.3%) were positive for Francisella sp., nine (15.8%) for F. tularensis and/or F. novicida, and four (7.0%) for F. tularensis subsp. holarctica. Ratios were 25/30 (83.3%), 24/30 (80.0%), and 4/30 (13.3%) for the second campaign. Among the thirty sites sampled during the two campaigns, nine were positive both times for Francisella sp., seven for F. tularensis and/or F. novicida, and one for F. tularensis subsp. holarctica. Altogether, our study reveals a high prevalence of Francisella sp. DNA (including the tularemia agent) in the studied aquatic environment. This aquatic environment could therefore participate in the endemicity of tularemia in the west of France.

Francisella tularensis is a highly virulent bacterium causing tularemia zoonosis. An increasing proportion of infections occur through contaminated hydro-telluric sources, especially for the subspecies holarctica ( Fth ). Although this bacterium has been detected in several aquatic environments, the mechanisms of its long-term persistence in water are not yet elucidated. We evaluated the culturability and the viability of a virulent Fth strain in independent microcosms filled with nutrient-poor water. At 37°C, the bacteria remained culturable for only one week, while culturability was extended to 6 weeks at 18°C and up to 11 weeks at 4°C. However, while the viability of the bacteria declined similarly to culturability at 37°C, the viability of the bacteria remained stable overtime at 18°C and 4°C for more than 24 months, long after loss of culturability. We identified water temperature as one of the major factors driving the aquatic survival of Fth through a transition of the whole Fth population in a viable but non-culturable (VBNC) state. Low temperature of water (≤18°C) favors the persistence of the bacteria in a VBNC state, while a temperature above 30°C kills culturable and VBNC Fth bacteria. These findings provide new insights into the environmental cycle of Francisella tularensis that suggest that the yet unidentified primary reservoir of the subspecies holarctica may be the aquatic environment itself in which the bacteria could persist for months or years without the need for a host.

La tularémie est une zoonose causée par la bactérie à Gram-négatif Francisella tularensis. Deux sous-espèces sont virulentes pour l’humain : F. tularensis ssp. tularensis, présente uniquement en Amérique du Nord et F. tularensis ssp. holarctica, présente dans tout l’hémisphère Nord et en Australie. Il existe des contaminations d’origine environnementale notamment par des aérosols contenant la bactérie, à l’origine d’infections pulmonaires. Cette possibilité ainsi que la haute pathogénicité de cette bactérie pour l’humain, la classe parmi les agents potentiels de bioterrorisme. Afin de maîtriser une dispersion accidentelle de F. tularensis, il est nécessaire de comprendre ses mécanismes de survie dans l’environnement. Le cycle de vie terrestre de F. tularensis ssp. holarctica est relativement bien caractérisé. A l’inverse, le cycle de vie aquatique de cette sous-espèce est encore peu caractérisé. Des contaminations humaines sporadiques et des épidémies d’origine aquatique existent après des activités aquatiques, l’ingestion d’eau contaminée ou des piqures de moustiques. Quelques études ont rapporté la persistance de F. tularensis pendant plusieurs semaines dans l’environnement, sans que les mécanismes de cette survie ne soient identifiés.L’objectif de ce travail de thèse était de caractériser la persistance de F. tularensis ssp. holarctica dans un environnement aquatique. Deux études de terrain réalisées en 2019 et en 2020 ont démontré la présence d’ADN de F. tularensis dans des étendues d’eau environnementales en France. Sur l’ensemble des deux campagnes, 9,2 % des 87 échantillons d’eau analysés contenaient de l’ADN de la bactérie responsable de la tularémie. Bien que la présence d’ADN ne soit pas une preuve de la persistance aquatique de la bactérie sous une forme infectieuse, ce travail questionne sur la survie à long terme de F. tularensis dans l’eau environnementale, et sur sa responsabilité dans certains cas de tularémie.Des modèles in vitro de survie environnementale d’une souche virulente de F. tularensis ssp. holarctica ont permis de démontrer que cette bactérie était capable de passer dans un état de dormance appelé état viable mais non-cultivable (VBNC). Dans cet état, les bactéries, n’étaient plus capables de pousser en milieu riche adapté, mais restaient vivantes. Cet état a permis aux bactéries de persister plus de 18 mois dans l’eau en échappant aux outils de détections classiques basés sur la culture bactérienne. La température de l’eau semble être un facteur essentiel pour la survie de F. tularensis, car l’état VBNC n’a été induit que dans de l’eau fraîche (4 et 18°C), alors que de l’eau plus chaude (37°C) était létale pour les bactéries en quelques jours. Bien que l’état VBNC soit un moyen de résister aux stress environnementaux, les bactéries à l’état VBNC restaient sensibles à la température, ce qui pourrait expliquer la répartition géographique de la tularémie et la persistance bactérienne limitées aux pays de l’hémisphère Nord.Une caractérisation protéomique de F. tularensis à l’état VBNC a été initiée pour finir ce travail de thèse. Un remodelage de l’enveloppe bactérienne et une régulation des facteurs de virulence semble s’opérer dans cet état de dormance. Une réduction des protéines synthétisant le peptidoglycane, les pili de type IV, le système de sécrétion de type VI et l’antigène-O a été observée.Les résultats complémentaires de ces travaux ont permis de proposer une actualisation du cycle de vie aquatique de F. tularensis ssp. holarctica. Ce travail de thèse a démontré que F. tularensis ssp. holarctica est capable de survivre plusieurs mois dans un environnement aquatique à l’état VBNC soulevant de nouvelles questions sur la résistance et la virulence de ces bactéries à l’état VBNC dans l’environnement qui devront faire l’objet de futures investigations.