Hepatocellular carcinoma (HCC) is a type of liver cancer with a poor prognosis for survival given the complications it bears on the patient. Though damages to the liver are acknowledged prodromic factors, the precise molecular aetiology remains ill-defined. However, many genes coding for proteins involved in calcium (Ca²⁺) homeostasis emerge as either mutated or deregulated. Ca²⁺ is a versatile signalling messenger that regulates functions that prime and drive oncogenesis, favouring metabolic reprogramming and gene expression. Ca²⁺ is present in cell compartments, between which it is trafficked through a network of transporters and exchangers, known as the Ca²⁺ transportome. The latter regulates and controls Ca²⁺ dynamics and tonicity. In HCC, the deregulation of the Ca²⁺ transportome contributes to tumorigenesis, the formation of metastasizing cells, and evasion of cell death. In this review, we reflect on these aspects by summarizing the current knowledge of the Ca²⁺ transportome and overviewing its composition in the plasma membrane, endoplasmic reticulum, and the mitochondria.

In the perspective to evaluate the toxicity of drug candidates or the exploration of intracellular signaling pathways of cell stress response and pathophysiological conditions, we propose to evaluate cell death, autophagy, mitochondrial network and energetic metabolism by a series of optimized joint protocols for neonatal primary rat cardiomyocytes or H9c2 cardiac cell line in 96 well microtiter plates. We used Digitoxigenin and Digoxin, two cardiac glycosides, and Rapamycin as control drugs, for inhibition of oxidative stress-induced cell death and autophagy induction, respectively.

Cancer metabolism depends on multifaceted mechanisms, including bidirectional inter-organelle communication between mitochondria and the nucleus, facilitating cellular adaptation at the transcriptomic, proteomic, and metabolomic levels. The mitochondrial protein complex composed of apoptosis-inducing factor (AIF) and coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 4 (CHCHD4) is essential for this mitochondrio-nuclear communication. The AIF/CHCHD4 complex mediates the mitochondrial import of cysteine-enriched nuclear gene-encoded proteins, thereby adapting the mitochondrial proteome to cellular energy demands. Here, we report the discovery of M30-E05, a compound that binds to the NADH pocket of AIF, preventing its dimerization and disrupting the AIF/CHCHD4 complex, as demonstrated by molecular docking and gel electrophoresis analysis of mitochondrial AIF/CHCHD4 substrate expression. In cancer cells, M30-E05 reduces the expression of nuclear gene-encoded mitochondrial proteins such as AIF, CHCHD4, cytochrome c oxidase copper chaperone (COX17), and Mitochondrial calcium uptake 1 (MICU1). In addition, M30-E05 fragments the mitochondrial network and impairs mitochondrial respiration, causing profound alterations, particularly in glucose, lipid, and amino acid metabolism, as revealed by kinetic measurements of oxygen consumption and mass spectrometric metabolomics. Importantly, M30-E05 significantly reduces the viability of a human adult and pediatric osteosarcoma cancer cell panel, including those from patient-derived xenografts (PDX) of osteosarcomas, and induces apoptosis. When orally administered for two weeks to immunodeficient NSG mice, M30-E05 inhibited tumor growth in a subcutaneous PDX xenograft model without apparent toxicity. We anticipate that M30-E05, as a first-in-class metabolic inhibitor, could serve as the lead compound for a new class of antineoplastic agents.

Rôle du complexe AIF/CHCHD4 dans l'ostéosarcome pédiatrique : développement de petites molécules et ciblage de vulnérabilités métaboliques: L'ostéosarcome est une tumeur osseuse maligne pédiatrique touchant principalement les adolescents et jeunes adultes, avec un risque élevé de rechute et aucun progrès pronostique depuis plus de quatre décennies. Les agents chimio-thérapeutiques sont parfois inefficaces chez certains patients en raison d'une chimiorésistance primaire ou acquise, soulignant le besoin d'approches ciblées plus efficaces pour surmonter cette résistance. La reprogrammation métabolique (RM), une caractéristique clé du cancer, est une cible thérapeutique intéressante à explorer. En effet, le métabolisme du cancer repose sur des mécanismes complexes, incluant la communication inter-organelle entre mitochondries et noyau, facilitant l'adaptation cellulaire aux niveaux transcriptomique, protéomique et métabolomique. Le complexe protéique mitochondrial composé des protéines apoptosis-inducing factor (AIF) et coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 4 (CHCHD4) est crucial pour cette communication. Il régule l'import de substrats protéiques codés par le noyau, riches en cystéine, dans les mitochondries, adaptant ainsi le protéome mitochondrial aux besoins énergétiques et fonctionnels, particulièrement dans le contexte du cancer. Nous émettons l'hypothèse que l'inhibition de ce complexe réduirait la flexibilité métabolique, compromettant la survie des cellules cancéreuses surexprimant AIF/CHCHD4 et/ou dépendantes des mitochondries. Ce complexe représente une cible prometteuse pour le traitement du cancer.Premièrement, j'ai décrit la découverte de M30-E05, un nouveau composé identifié par criblage à haut débit robotisé comme inhibiteur d'AIF/CHCHD4. Celui-ci se lie à la poche NADH de l'AlF, empêchant sa dimérisation et perturbant la formation du complexe AIF/CHCHD4. Dans des modèles cellulaires d'ostéosarcome, M30-E05 réduit l'expression d'AlF et CHCHD4 ainsi que leurs substrats protéiques mitochondriaux, fragmente le réseau mitochondrial, altère la respiration mitochondriale, entraînant des altérations profondes, notamment dans le métabolisme des lipides et des acides aminés. M3O-EO5 réduit significativement la viabilité de divers modèles d'ostéosarcome par apoptose, incluant des lignées cellulaires et des xénogreffes dérivées de patients (PDX) in vitro et in vivo. Administré par voie orale pendant deux semaines, le M30-E05 a inhibé la croissance tumorale dans des souris NSG xénogreffées de PDX sans toxicité. Premier inhibiteur métabolique de sa classe, M30-E05 est prometteur comme un «lead» pour un nouvel agent antinéoplasique. Ce travail a mené à un brevet (EP24202518.7) dont je suis co-propriétaire.La deuxième partie de ma thèse explore la mitoxantrone, un médicament repositionné, identifié comme inhibiteur d'AIF/CHCHD4 par criblage à haut débit. Comme le M30-E05, la mitoxantrone affecte les substrats AIF/CHCHD4 et la respiration mitochondriale, induisant une RM dans les modèles d'ostéosarcome in vitro. Contrairement au M30-E05, elle agit via la déplétion de la protéine Mitochondrial Calcium Uniport 1 (MICU1), causant une accumulation excessive de calcium mitochondrial et favorisant la synthèse de nucléotides par glutaminolyse, notamment la synthèse de novo de purines. Cela suggère une RM vers le métabolisme de la glutamine et des nucléotides comme mécanisme adaptatif, indiquant une vulnérabilité métabolique ciblable. Puis, nous avons démontré que la combinaison synergique de mitoxantrone et telaglenastat, un inhibiteur de glutaminase, inhibe cette RM et amplifie la toxicité de la mitoxantrone dans des modèles d'ostéosarcome in vitro et in vivo.Mon travail de thèse met en lumière le complexe AIF/CHCHD4 comme une cible thérapeutique prometteuse pour l'ostéosarcome, avec des applications potentielles dans d'autres cancers. Ainsi, nous confirmons que cibler les vulnérabilités métaboliques offre une nouvelle stratégie pour développer des régimes combinatoires contre le cancer.

Osteosarcoma is a malignant bone tumor with a high risk of metastatic relapse and poor outcomes due to primary and acquired chemoresistance. This highlights the medical need to develop effective targeted approaches to overcome chemoresistance. Recent studies have revealed the roles of metabolic reprogramming and mitochondria-nucleus crosstalk in osteosarcoma progression, indicating the potential of these cellular processes as therapeutic targets. The complex formed by mitochondrial apoptosis-inducing factor (AIF) and coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 4 (CHCHD4) orchestrates the import and oxidative folding of cysteine-rich, nuclear-encoded proteins, thereby regulating key mitochondrial functions and metabolism. Here, we identified mitoxantrone as an inhibitor of the AIF/CHCHD4 mitochondrial import machinery and revealed a new mitoxantrone-induced metabolic vulnerability in some osteosarcoma cell line models, characterized by intracellular glutamine accumulation and an increase in nucleotide synthesis. As a result, synergy was found between mitoxantrone and the glutaminase inhibitor telaglenastat in both in vitro and in vivo osteosarcoma models. Collectively, our findings position the AIF/CHCHD4 complex as a druggable therapeutic target and provide a combination strategy for mitoxantrone/telaglenastat treatment to overcome metabolic adaptations and chemoresistance in osteosarcoma.

Osteosarcoma is a malignant bone tumor with a high risk of metastatic relapse and poor outcomes due to primary and acquired chemoresistance. This highlights the medical need to develop effective targeted approaches to overcome chemoresistance. Recent studies have revealed the roles of metabolic reprogramming and mitochondria-nucleus crosstalk in osteosarcoma progression, indicating the potential of these cellular processes as therapeutic targets. The complex formed by mitochondrial apoptosis-inducing factor (AIF) and coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 4 (CHCHD4) orchestrates the import and oxidative folding of cysteine-rich, nuclear-encoded proteins, thereby regulating key mitochondrial functions and metabolism. Here, we identified mitoxantrone as an inhibitor of the AIF/CHCHD4 mitochondrial import machinery and revealed a new mitoxantrone-induced metabolic vulnerability in some osteosarcoma cell line models, characterized by intracellular glutamine accumulation and an increase in nucleotide synthesis. As a result, synergy was found between mitoxantrone and the glutaminase inhibitor telaglenastat in both in vitro and in vivo osteosarcoma models. Collectively, our findings position the AIF/CHCHD4 complex as a druggable therapeutic target and provide a combination strategy for mitoxantrone/telaglenastat treatment to overcome metabolic adaptations and chemoresistance in osteosarcoma.