Hfq is a bacterial master regulator which promotes the pairing of nucleic acids. Due to the high molecular weight of the complexes formed between nucleic acids and the amyloid form of the protein, it is difficult to analyze solely by a gel shift assay the complexes formed, as they all migrate at the same position in the gel. In addition, precise kinetics measurements are not possible using a gel shift assay. Here, we used a synchrotron-based biophysical approach, synchrotron radiation circular dichroism (SRCD), to probe the interaction of the Escherichia coli Hfq C-terminal amyloid region with nucleic acids involved in the control of ColE1-like plasmid replication. We observed that this C-terminal region of Hfq has an unexpected and significant effect on the annealing of nucleic acids involved in this process and, more importantly, on their alignment. Functional consequences of this newly discovered property of the Hfq amyloid region are discussed in terms of the biological significance of Hfq in the ColE1-type plasmid replication process and antibiotic resistance.

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a widely utilized technique for studying the structures of chiral molecules, including nucleic acids. It is particularly valued for its ability to quickly probe structural changes in these biomolecules. Despite its potential, the prediction of nucleic acid structures by CD has been challenging due to insufficient families’ reference spectral data. This study introduces a robust method for defining CD spectra families of nucleic acid structures. We developed an iterative workflow that accurately classifies spectra for nucleic acid structures in solution. Our approach demonstrates high robustness and accuracy in assigning CD spectra to specific nucleic acid folds, facilitating advancements in nucleic acid structure analysis. The algorithm we developed identifies structural classes based on reference spectra, aiding in the assignment of unknown spectra. This method paves the way for creating a comprehensive list of reference spectra for various nucleic acid structures, like those already available for proteins.

Polyphosphate (polyP), a ubiquitous and highly conserved biopolymer, has emerged as a potential modulator of bacterial amyloidogenesis. In bacteria, polyP contributes to the formation of dense intracellular regions associated with transcriptional silencing. Gene regulation and chromatin organization are primarily controlled by nucleoid‐associated proteins (NAPs), including the highly conserved RNA chaperone Hfq. Recent studies suggest that polyP alters Hfq function, promoting genomic instability through increased mutagenesis and DNA damage. In vitro , Hfq interacts with polyP and nucleic acids to form phase‐separated condensates, a process mediated by its intrinsically disordered C‐terminal region (CTR). In this study, we investigated the impact of polyP on the amyloidogenic behavior of Hfq. Our results reveal that, contrary to expectations, polyP alone does not induce amyloid formation in the isolated CTR. However, in the presence of polyadenylated RNA, polyP significantly enhances Hfq amyloidogenesis. These findings suggest a previously unrecognized role for polyP in RNA‐mediated phase separation using amyloid self‐assembly and provide new insights into the molecular mechanisms underlying bacterial stress tolerance.

Understanding the structural conformation and dynamics of nucleic acids in solution is critical for the development of nucleic acid therapeutics involving antisense or mRNA therapies, where controlling stability, efficacy, and manufacturability are important. Circular dichroism (CD) spectroscopy allows rapid and nondestructive solution analysis of the spatial arrangements of nucleic acids. While widely used to analyze protein structure, the potential of CD for DNA- and RNA-based pharmaceutical applications has remained largely unrealized because nucleic acid spectra are complex and difficult to interpret quantitatively. We introduce herein a framework (NA-CDQuant) that transforms CD from a qualitative fingerprinting method into a quantitative tool for nucleic acid structure prediction by combining spectral deconvolution with a rigorously curated synchrotron radiation circular dichroism reference library comprising 18 structurally defined conformational families. This systematic classification overcomes long-standing challenges posed by spectral overlap and structural polymorphism, enabling estimation of the fractional composition of coexisting conformations during real-time monitoring of structural transitions in solution. NA-CDQuant provides mechanistic insight into subtle conformational redistributions that may affect molecular recognition and functional performance assisting pharmaceutical development and medical application by facilitating formulation optimization, stability assessment, quality control, and regulatory support of nucleic acid–based therapeutics.

La relation structure/fonction des acides nucléiques (AN) constitue un enjeu fondamental de la biologie moléculaire moderne. Si l'ADN et l'ARN ont longtemps été étudiés principalement pour leur rôle dans le stockage et la transmission de l'information génétique, il est désormais clairement établi que leurs propriétés structurales, dynamiques et conformationnelles conditionnent la grande diversité de leurs fonctions biologiques. Leur plasticité structurale, et plus particulièrement celle des ARN, permet l'adoption de structures secondaires et tertiaires variées, directement impliquées dans la régulation de l'expression génétique, l'assemblage de complexes ribonucléoprotéiques, la catalyse ou la signalisation cellulaire. Dans ce contexte, l'identification et la caractérisation de la dynamique des acides nucléiques en solution apparaissent comme un défi méthodologique majeur, tant pour la recherche fondamentale que pour des applications bio-médicales et industrielles. Cet enjeu est particulièrement critique dans le cas des ARN messagers, pour lesquels l'intérêt s'est considérablement accru avec le développement des vaccins à ARNm. La stabilité, l'organisation tridimensionnelle et l'homogénéité structurale des ARNm conditionnent directement leur efficacité biologique, leur immunogénicité et leur robustesse lors des étapes de production, de formulation et de stockage. Toutefois, l'étude structurale des ARNm qui sont de grande taille et peu structurés demeure complexe. Dans ce cadre, cette thèse explore et développe l'utilisation de la spectroscopie de dichroïsme circulaire (DC) comme outil d'analyse de la structure des acides nucléiques complexes. L'objectif principal de ce travail de thèse était d'établir un cadre méthodologique complet permettant l'analyse structurale des acides nucléiques par DC, depuis la constitution de ressources de référence jusqu'à leur application à des systèmes biologiques. La première contribution de cette thèse réside dans l'établissement de la Nucleic Acid Circular Dichroism DataBase (NACDDB), première base de données dédiée aux spectres de DC des acides nucléiques. La NACDDB que nous avons créée propose un format unifié associant à chaque spectre des informations détaillées concernant la séquence, la nature chimique de l'acide nucléique et les conditions expérimentales. La NACDDB constitue une ressource de référence rigoureuse permettant une comparaison inter-expérimentale. Sur la base de ces données de référence DC, un travail a été mené afin de définir des signatures spectrales caractéristiques des principales structures secondaires ou tertiaires adoptées par les acides nucléiques. Une approche originale a été développée, reposant sur l'exploitation conjointe des spectres DC et des informations structurales connues issues de la littérature et de la conception théorique des séquences étudiées. À partir d'un jeu de données étendu et soigneusement annoté, dix-huit références spectrales distinctes ont été définies. Ces références spectrales ont servi de base au développement d'une méthode de déconvolution des spectres de dichroïsme circulaire des acides nucléiques. La méthode développée dans cette thèse permet une estimation de la composition en structures secondaires d'oligonucléotides. Enfin, les méthodes développées au cours de cette thèse ont été appliquées à l'étude de la structure d'ARNm viraux utilisés dans le cadre du développement de vaccins à ARNm. Cette analyse montre une concordance satisfaisante entre les proportions de régions double brin et désordonnées. Cette thèse établit donc un cadre méthodologique cohérent pour l'exploitation du dichroïsme circulaire dans l'étude de la structure des acides nucléiques.