Autophagy is a pleiotropic and evolutionarily conserved process in eukaryotes that encompasses different types of mechanisms by which cells deliver cytoplasmic constituents to the lysosome for degradation. Interestingly, in mammals, two different and specialized autophagic pathways, (i) the chaperone-mediated autophagy (CMA) and (ii) the endosomal microautophagy (eMI), both rely on the use of the same cytosolic chaperone HSPA8 (also known as HSC70) for targeting specific substrates to the lysosome. However, this is not true for all organisms, and differences exist between species with respect to the coexistence of these two autophagic routes. In this paper, we present an in-depth analysis of the evolutionary history of the main components of CMA and eMI and discuss how the observed discrepancies between species may contribute to improving our knowledge of these two functions and their interplays.

Chaperone-mediated autophagy (CMA) is a major pathway of lysosomal proteolysis critical for cellular homeostasis and metabolism, and whose defects have been associated with several human pathologies. While CMA has been well described in mammals, functional evidence has only recently been documented in fish, opening up new perspectives to tackle this function under a novel angle. Now we propose to explore CMA functions in the rainbow trout (RT, Oncorhynchus mykiss), a fish species recognized as a model organism of glucose intolerance and characterized by the presence of two paralogs of the CMA-limiting factor Lamp2A (lysosomal associated membrane protein 2A). To this end, we validated a fluorescent reporter (KFERQ-PA-mCherry1) previously used to track functional CMA in mammalian cells, in an RT hepatoma-derived cell line (RTH-149). We found that incubation of cells with high-glucose levels (HG, 25 mM) induced translocation of the CMA reporter to lysosomes and/or late endosomes in a KFERQ- and Lamp2A-dependent manner, as well as reduced its half-life compared to the control (5 mM), thus demonstrating increased CMA flux. Furthermore, we observed that activation of CMA upon HG exposure was mediated by generation of mitochondrial reactive oxygen species, and involving the antioxidant transcription factor Nfe2l2/Nrf2 (nfe2 like bZIP transcription factor 2). Finally, we demonstrated that CMA plays an important protective role against HG-induced stress, primarily mediated by one of the two RT Lamp2As. Together, our results provide unequivocal evidence for CMA activity existence in RT and highlight both the role and regulation of CMA during glucose-related metabolic disorders.

Chaperone-Mediated Autophagy (CMA) is a major pathway of lysosomal proteolysis involved in numerous cellular processes, and whose dysfunction is associated to several pathologies. Initially studied in mammals and birds, recent findings have identified CMA in fish, reshaping our understanding of its evolution across metazoans. Given the exciting perspectives this finding offered, we have now developed the required tools to investigate and functionally asses that CMA function in a powerful fish genetic model: the zebrafish ( Danio rerio ). After adapting and validating a fluorescent reporter (KFERQ-Dendra2; previously used to track CMA in mammalian cells) in zebrafish primary embryonic cells, we first demonstrated CMA functionality in this fish species. Then, we developed a transgenic zebrafish line expressing the KFERQ-Dendra2 CMA reporter, enabling the real-time tracking of CMA activity in vivo . This model revealed heterogeneous CMA responses within tissues, highlighting the zebrafish as a valuable model for investigating tissue-specific and cell-scale variations in CMA. Moreover, a novel role for CMA has been uncovered, acting as a gatekeeper of sperm cell proteostasis, thereby playing a crucial role in the production of active and high-quality spermatozoa. Overall, these findings emphasize the zebrafish as a pivotal model for advancing our comprehension of the fundamental mechanisms underlying CMA.

Comprendre et exploiter l'autophagie médiée par les protéines chaperonnes chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss): L'autophagie médiée par les chaperonnes (CMA) est une voie cellulaire responsable de la dégradation des protéines, assurant l'homéostasie cellulaire face à divers stress tels que le jeûne, le stress oxydatif et l'hypoxie. Bien que largement étudiée chez les mammifères, l'existence de la CMA chez les poissons n'a été confirmée que récemment, offrant des perspectives passionnantes quant à son rôle chez les espèces confrontées au stress environnemental.Dans cette thèse de doctorat, j'ai d'abord examiné les particularités évolutives des éléments clés de la CMA pour déceler des indications de l'existence possible de la CMA chez la truite arc-en-ciel (RT, Oncorhynchus mykiss). Les résultats montrent que les acteurs principaux de la CMA au cours de l'évolution des vertébrés sont présents et pourraient potentiellement être fonctionnels chez la RT. Le facteur limitant de la CMA, la protéine membranaire associée au lysosome 2A (Lamp2A), est apparu au début de la radiation évolutive des vertébrés, indiquant ainsi que la CMA est spécifique à cette lignée. Cependant, nous avons constaté une grande variabilité de séquence dans les différents domaines fonctionnels de Lamp2A entre les vertébrés phylogénétiquement éloignés, suggérant potentiellement que la fonction de la CMA a évolué différemment entre les espèces.Par la suite, mon objectif était de mesurer l'expression de l'ARNm des gènes liés à la CMA tout au long des stades de développement ainsi que dans les tissus adultes de la RT. Les résultats ont montré que la RT possède tout le matériel génétique nécessaire pour exprimer la machinerie de la CMA, en particulier dans les tissus impliqués dans les processus métaboliques majeurs.Afin d'établir fermement l'existence d'une activité fonctionnelle de la CMA chez cette espèce, nous avons ensuite réalisé une étude in vitro en utilisant des lysosomes isolés. Nos résultats ont révélé que la RT présente indubitablement une activité CMA, qui augmente 21 fois lors du jeûne, un inducteur connu de la CMA. Enfin, nous avons utilisé l'outil d'édition du génome CRISPR-Cas9 pour créer une lignée déficiente en Lamp2A. Les poissons Lamp2A KO ont montré des altérations physiologiques significatives, notamment une augmentation de la taille et du poids corporels, ainsi qu'un remodelage substantiel du protéome hépatique.Étant donné que la CMA chez les mammifères est impliquée dans le maintien de l'homéostasie cellulaire, nous avons anticipé qu'un rôle similaire pourrait être observé chez la RT. À cet égard, nous avons utilisé le 'CMA score', un indicateur fiable de l'état d'activation de la CMA basé sur les niveaux d'expression des effecteurs clés et des régulateurs de la CMA, pour évaluer le stress cellulaire chez la RT, et potentiellement chez d'autres espèces de poissons. Une étude in vitro impliquant des lignées cellulaires de la RT soumises à différents activateurs connus de la CMA a été réalisée, car l'activité de la CMA peut être quantifiée en utilisant un rapporteur de la CMA KFERQ-PA-mCherry1, une méthode largement utilisée chez les cellules de mammifères. Enfin, nous avons exploré les variations spécifiques aux tissus dans la réponse du CMA score à l'exposition au mercure (Hg) et avons constaté une activation spécifique de la machinerie CMA en fonction des organes. Ces découvertes mettent en évidence l'utilité du CMA score en tant que marqueur indicatif de l'homéostasie cellulaire chez les organismes actuellement exposés à des menaces environnementales, tout en permettant l'évaluation du potentiel CMA dans les modèles émergents.

Chaperone-Mediated Autophagy (CMA) is a major pathway of lysosomal proteolysis critical for cellular homeostasis and metabolism. While extensively studied in mammals, CMA’s existence in fish has only been confirmed recently, offering exciting insights into its role in species facing environmental stress. Here, we shed light on the existence of 2 genes encoding the CMA-limiting factor Lamp2A (lysosomal associated membrane protein 2A) in rainbow trout (RT, Oncorhynchus mykiss ), revealing distinct expression patterns across various tissues. Notably, RT lacking the most expressed Lamp2A exhibit profound hepatic proteome disturbances during acute nutritional stress, underscoring its pivotal role as a guardian of hepatic proteostasis. Building upon these findings, we introduce and validate the CMA activation score as a reliable indicator of CMA status, providing a valuable tool for detecting cellular stress in fish under environmental threats. Overall, our study offers new perspectives into understanding CMA from evolutionary and environmental contexts. Abstract Figure: