Many pathogens manipulate host cell cAMP signaling pathways to promote their survival and proliferation. Bacterial Exoenzyme Y (ExoY) toxins belong to a family of invasive, structurally-related bacterial nucleotidyl cyclases (NC). Inactive in bacteria, they use proteins that are uniquely and abundantly present in eukaryotic cells to become potent, unregulated NC enzymes in host cells. Other well-known members of the family include Bacillus anthracis Edema Factor (EF) and Bordetella pertussis CyaA. Once bound to their eukaryotic protein cofactor, they can catalyze supra-physiological levels of various cyclic nucleotide monophosphates in infected cells. Originally identified in Pseudomonas aeruginosa, ExoY-related NC toxins appear now to be more widely distributed among various γ- and β-proteobacteria. ExoY-like toxins represent atypical, poorly characterized members within the NC toxin family. While the NC catalytic domains of EF and CyaA toxins use both calmodulin as cofactor, their counterparts in ExoY-like members from pathogens of the genus Pseudomonas or Vibrio use actin as a potent cofactor, in either its monomeric or polymerized form. This is an original subversion of actin for cytoskeleton-targeting toxins. Here, we review recent advances on the different members of the NC toxin family to highlight their common and distinct functional characteristics at the molecular, cytotoxic and enzymatic levels, and important aspects that need further characterizations.

The Type III Secretion System (T3SS) of Pseudomonas aeruginosa injects effector proteins into host cells to subvert cellular processes and promote infection. While the roles of several T3SS effectors in virulence are well established, the function of the nucleotidyl cyclase ExoY has remained elusive and debated. Here, we show that ExoY-produced cyclic GMP (cGMP) regulates the cytotoxic activity of the co-injected effector ExoT, thereby modulating host cell damage. Using engineered P. aeruginosa strains expressing ExoY variants with distinct substrate preferences, we demonstrate that cGMP production by ExoY limits ExoT-mediated dephosphorylation of the host adaptor protein CrkII, a downstream consequence of ExoT’s ADP-ribosyltransferase activity. This attenuation reduces ExoT-induced cell retraction and decreases bacterial virulence. In contrast, we find that ExoT and another T3SS effector, ExoS, can inhibit ExoY activity and cGMP production in certain cell types, thus limiting ExoY’s regulatory influence. These findings highlight the intricate interplay between T3SS effectors within host cells and reveal an unrecognized layer of ExoY-based complexity in P. aeruginosa ’s pathogenic strategy.

This review highlights the structural and mechanistic diversity of B ₁₂ -dependent radical SAM enzymes and their evolutionary links to other B ₁₂ -dependent enzymes.

ExoY virulence factors are members of a family of bacterial nucleotidyl cyclases (NCs) that are activated by specific eukaryotic cofactors and overproduce cyclic purine and pyrimidine nucleotides in host cells. ExoYs are actin-activated NC toxins. Here, we investigate the Vibrio nigripulchritudo Multifunctional-Autoprocessing Repeats-in-ToXin (MARTX) ExoY effector domain (Vn-ExoY) as a model for ExoY-type members that interact with monomeric (G-actin) rather than filamentous (F-actin) actin. Vn-ExoY binds with only modest affinity to free or profilin-bound G-actin, but can capture the G-actin:profilin complex for its own activation by preventing the spontaneous or VASP- or formin-mediated assembly of G-actin:profilin at the barbed ends of F-actin in vitro . This may prolong the lifetime of the cofactor-bound state of Vn-ExoY at sites of active actin cytoskeleton remodelling. A series of high-resolution crystal structures of nucleotide-free, 3’-deoxy-ATP- or 3’-deoxy-CTP-bound Vn-ExoY, activated by free or profilin-bound G-actin-ATP/-ADP show that the cofactor only partially stabilises the nucleotide-binding pocket (NBP) of all NC toxins. Substrate binding promotes a large, previously-unidentified, closure of their NBP. This confines catalytically important residues of the NC toxins and metal cofactors around the substrate and promotes the recruitment of two metal ions to tightly coordinate the triphosphate moiety of purine or pyrimidine nucleotide substrates. Residues that play an important role in both the purinyl and pyrimidinyl cyclase activity of NC toxins are validated in Vn-ExoY and the distantly-related ExoY from Pseudomonas aeruginosa that interact with F-actin. The data conclusively demonstrate that NC toxins employ a similar two-metal-ion mechanism for catalysing the cyclisation reaction of nucleotides of different sizes. These structural insights into the dynamics of the actin-binding interface of actin-activated ExoYs and the multi-step activation of all NC toxins open up new perspectives for identifying ways to specifically inhibit these bacterial NC enzymes. Author Summary: ExoY toxins belong to a family of bacterial nucleotidyl cyclases (NCs) that are injected into eukaryotic cells and bind to specific host cofactors to trigger their toxic, potent NC enzymatic activity. They alter host cell signalling by overproducing purine and pyrimidine cyclic nucleotides, which act as canonical and non-canonical intracellular messengers, respectively. The molecular and mechanistic details underlying the activation and catalytic specificities of NC toxins are only partially understood. Here, we investigate ExoY-type members that are unable to interact with actin filaments for their activation. We show in vitro that such ExoYs capture the actin:profilin complex for activation by disrupting its association with the most dynamic ends of actin filaments. We have captured several structural snapshots along the Vn-ExoY activation pathway by G-actin or G-actin-profilin without or with purine or pyrimidine nucleotide analogues. Our structural data reveal unprecedented mechanistic details of how the active site of all NC toxins is sequentially remodelled by cofactor and substrate binding, how they can accommodate nucleotides of different sizes as substrates, and elucidate important features of their catalytic reaction. These structural insights into the multi-step activation of NC toxins provide new perspectives for identifying ways to specifically inhibit this class of NC enzymes.

Étude Biochimique et Structurale des spécificités fonctionnelles d'une nouvelle famille de toxines bactériennes à activité nucléotidyl cyclase, appelées toxines de type ExoY, activées par l'actine: Résumé :Les toxines nucléotidyl cyclases (NC) bactériennes de type ExoY appartiennent à une sous-famille de NC bactériennes qui sont activées dans les cellules eucaryotes infectées en interagissant avec des cofacteurs eucaryotes spécifiques. Une fois activées, elles convertissent des nucléosides-5' triphosphate en nucléosides 3',5'-monophosphate cycliques (cNMP) et en pyrophosphate. La production de niveaux supraphysiologiques de cNMP perturbe diverses voies de signalisation intracellulaires dépendantes des cNMP. Alors que les membres les plus étudiés de la famille, le facteur d'œdème (EF) de Bacillus anthracis et la toxine CyaA de Bordetella pertussis, sont activés par calmoduline, les toxines ExoY utilisent un cofacteur atypique qui est l'actine. Les spécificités fonctionnelles et de virulence des toxines ExoY restent largement inconnues.L'Exoenzyme Y (Pa-ExoY) a d'abord été identifiée comme une exotoxine sécrétée par le système de sécrétion de type III (T3SS) de Pseudomonas aeruginosa (P. a., Pa), un agent pathogène humain majeur. Divers modules enzymatiques ou protéines effectrices de type ExoY ont été depuis identifiés dans des protéobactéries Gram négatives qui représentent des agents pathogènes humains ou animaux émergents.J'ai caractérisé en particulier le module ExoY (Vn-ExoY) de la toxine MARTX (Multifunctional-Autoprocessing Repeats-in-ToXin) de Vibrio nigripulchritudo, un pathogène marin émergent. Vn-ExoY montre une préférence pour l'ATP comme substrat mais peut également utiliser le CTP. En revanche, Pa-ExoY présente une activité NC différente avec la préférence de substrat suivante in vitro : GTP>ATP≥UTP>CTP. En outre, alors que Pa-ExoY se lient aux filaments d'actine (actine-F) pour une activation maximale, Vn-ExoY est sélectivement activée par l'actine monomérique (actine-G).Les bases structurales de ces spécificités fonctionnelles sont inconnues et ont été étudiées au cours de ma thèse.Au niveau structural les toxines NC bactériennes appartiennent à la classe II des adénylyl cyclases (AC) et ne présentent aucune homologie avec les AC de classe III des mammifères et peuvent donc représenter des cibles thérapeutiques potentielles.Mes travaux visent à comprendre les spécificités fonctionnelles, la relation structure-fonction des toxines ExoY et leurs cytotoxicités dans les cellules hôtes. J'ai caractérisé certaines spécificités fonctionnelles liées à l'utilisation de l'actine-G comme cofacteur en utilisant Vn-ExoY comme modèle.L'étude biochimique de la dynamique de l'auto-assemblage de l'actine montre que Vn-ExoY peut se fixer et être activée par le complexe profiline:actine-G, qui est abondant et essentiel pour la dynamique des extrémités barbées (ou +) des filaments dans les cellules eucaryotes. Ce complexe pourrait donc représenter le cofacteur physiologique des toxines ExoY activées par l'actine-G. Vn-ExoY inhibe in vitro l'association spontanée, ou médiée par des facteurs d'élongation, des complexes profiline:actine avec les extrémités (+) de l'actine-F, ce qui peut contribuer à la cytotoxicité de Vn-ExoY.J'ai aussi obtenu une série de structures cristallines de Vn-ExoY liée à l'ATP-/ADP-actine ou ADP-/ATP-actine-profiline avec divers analogues/dérivés de substrats ou produits. Certaines de ces structures sont en cours d'optimisation. Ces données structurales permettent d'identifier des éléments clés pour la reconnaissance et l'activation des toxines ExoY par l'actine-G ou -F, leurs réactions enzymatiques, leur inhibition, et leurs différentes préférences de substrats. Elles démontrent que les toxines ExoY utilisent un mécanisme catalytique à deux ions métalliques. Elles fournissent différents instantanés des changements conformationnels de Vn-ExoY qui sont induits par l'actine ou le substrat, et qui sont cruciaux pour la stabilisation du substrat et la catalyse dans toutes les toxines NC structurellement apparentées. Ces éléments peuvent représenter des pistes pour inhiber ces toxines.