Overactivation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is a critical driver of many human cancers. However, therapies directly targeting this pathway lead to cancer drug resistance. Resistance has been linked to compensatory RAS overexpression, but the mechanisms underlying this response remain unclear. Here, we find that MEK inhibitors (MEKi) are associated with an increased translation of the KRAS and NRAS oncogenes through a mechanism involving dissolution of processing body (P-body) biocondensates. This effect is seen across different cell types and is extremely dynamic since removal of MEKi and ERK reactivation result in reappearance of P-bodies and reduced RAS-dependent signaling. Moreover, we find that P-body scaffold protein levels negatively impact RAS expression. Overall, we describe a new feedback loop mechanism involving biocondensates such as P-bodies in the translational regulation of RAS proteins and MAPK signaling.

Les Processing-bodies (P-bodies) sont des granules cytoplasmiques sans membrane qui jouent un rôle dans divers processus cellulaires, en stockant des ARNm réprimés. Les P-bodies se forment par la coalescence des ARN et de plusieurs protéines de liaison à l'ARN, par séparation de phase liquide-liquide. Malgré les récentes découvertes concernant leurs composants clés, les voies cellulaires qui régulent les P-bodies sont encore mal comprises. Nous avons donc réalisé un criblage pour identifier des drogues modulant la formation des P-bodies.Pour la première partie de mon projet de thèse, nous avons décidé de travailler sur des médicaments qui affectent la dissolution des P-bodies avec des conséquences sur la traduction des oncogènes. Dans de nombreux cancers humains, la voie des MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) est suractivée. Par conséquent, des thérapies ciblant cette voie ont été développées, telles que les inhibiteurs de MEK, mais cela conduit à des résistances dans le cancer. Une voie possible de résistance a été liée à la surexpression compensatoire des oncogènes RAS, mais les mécanismes sous-jacents à cette réponse sont encore méconnus. Nous avons découvert qu'après le traitement par un inhibiteur de MEK, les P-bodies sont dissous, entraînant une augmentation de la traduction de KRAS et NRAS, deux oncogènes en amont de la voie MAPK. En résumé, nous avons décrit un nouveau mécanisme de boucle de rétrocontrôle impliquant les P-bodies dans la régulation traductionnelle des protéines RAS et de la signalisation MAPK.Pour la deuxième partie de mon projet, nous avons travaillé sur des modulateurs qui augmentent la formation des P-bodies. Nous avons découvert que les glucocorticoïdes (GC) étaient capables de remodeler le nombre et la taille des P-bodies après 48 heures de traitement. En combinant des expériences de microscopie et de biochimie, nous avons montré que cette régulation des P-bodies est associée à l'activation dose-dépendante du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) en réponse à son ligand (la dexaméthasone, un GC). Pour mieux comprendre le lien entre l'activation du GR et la formation des P-bodies, nous avons étudié les isoformes du GR, alpha et bêta étant les plus abondantes. L'isoforme alpha du GR est connue pour se lier aux GC, tandis que l'isoforme bêta a perdu cette capacité. Ainsi, nous avons voulu décrypter l'influence des différentes isoformes du GR sur la régulation des P-bodies. Pour cela, nous avons utilisé des cellules CRISPR Cas9 dans lesquelles le GR est supprimé et nous avons compensé cette suppression avec soit l'isoforme alpha, soit l'isoforme bêta et différents mutants. Nos résultats montrent que l'isoforme alpha est responsable de l'activation de la voie de signalisation du GR. Cette activation conduit à une augmentation du nombre de P-bodies et à une diminution de leur taille, ce qui implique que cette isoforme est importante pour la régulation des P-bodies. En résumé, nos résultats révèlent un lien entre l'activation du GR alpha et la régulation des P-bodies. Nous prévoyons maintenant de réaliser des analyses transcriptomiques et protéomiques sur nos cellules pour déterminer si l'activation induite par les GC sur le GR entraîne une altération de la corrélation ARNm/protéine et pour trouver des cibles qui régulent directement la formation des P-bodies par l'activation du GR.En résumé, mon projet de thèse nous a permis de caractériser de nouvelles voies cellulaires qui contrôlent la régulation des P-bodies. Nous avons montré que les médicaments peuvent avoir différents effets sur la formation des P-bodies, modifiant ainsi leur contenu et altérant par conséquent la traduction des ARNm. Ce phénomène pourrait être impliqué dans le développement de résistances et/ou effets secondaires aux médicaments.

Processing bodies (P-bodies) are cytoplasmic, membraneless organelles that play a key role in regulating RNA translation. To identify new pathways controlling their formation, we conducted a Food and Drug Administration (FDA)-approved drug screen. We found that glucocorticoids, among the most prescribed medicines, significantly increase P-body numbers across diverse epithelial cell types. This effect was fully reversible after glucocorticoid withdrawal, illustrating the adaptive dynamics of P-bodies. Using genetic invalidation and rescue approaches, we demonstrated that this accumulation requires the Glucocorticoid Receptor alpha isoform. P-body accumulation was associated with the sequestration of P-body-specific-targeted mRNAs, altering their translation yield. Notably, this translational regulation depends on transcript sequence features rather than abundance, with AU-rich mRNA transcripts being sequestered and GC-rich mRNAs preferentially translated under glucocorticoid treatment. Furthermore, we linked the decrease of LSM14B, a negative regulator of P-bodies, under glucocorticoid treatment to P-body reshaping. Our results reveal that, beyond their known transcriptional activity, prolonged exposure to glucocorticoids influences mRNA post-transcription and translation through a nucleotide composition-based mechanism.

Overactivation of the Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is a critical driver of many human cancers. However, therapies targeting this pathway have proven effective in only a few cancers, as cancers inevitably develop resistance. Puzzling observations suggest that MAPK targeting fails in tumors due to early compensatory RAS overexpression, albeit by unexplained mechanisms. We identified a novel mechanism of drug tolerance to MEK inhibitors (MEKi) that involves Processing Bodies (PBs), a membraneless organelle (MLO). MEKi promoted translation of the oncogenes KRAS and NRAS, which in turn triggered BRAF phosphorylation. This overexpression, which occurred in the absence of neotranscription, depended on PB dissolution as the source of the RAS mRNA. Moreover, in response to MEKi removal, the process was dynamic as PBs rapidly reformed and reduced MAPK signaling. These results highlight a dynamic spatiotemporal negative feedback loop of MAPK signaling via RAS mRNA sequestration. Furthermore, we observed a phenotype with a low number of PBs along with strong KRAS and NRAS induction capacities. Overall, we describe a new intricate mechanism involving PBs in the translational regulation of essential cellular signaling pathways like MAPKs, paving the way for future therapies altering MLO and thereby improving targeted cancer therapies.