REarranged during Transfection (RET) oncogenic rearrangements can occur in 1–2% of lung adenocarcinomas. While RET-driven NSCLC models have been developed using various approaches, no model based on patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) has yet been described. Patient-derived iPSCs hold great promise for disease modeling and drug screening. However, generating iPSCs with specific oncogenic drivers, like RET rearrangements, presents challenges due to reprogramming efficiency and genotypic variability within tumors. To address this issue, we aimed to generate lung progenitor cells (LPCs) from patient-derived iPSCs carrying the mutation RET^C634Y, commonly associated with medullary thyroid carcinoma. Additionally, we established a RET^C634Y knock-in iPSC model to validate the effect of this oncogenic mutation during LPC differentiation. We successfully generated LPCs from RET^C634Y iPSCs using a 16-day protocol and detected an overexpression of cancer-associated markers as compared to control iPSCs. Transcriptomic analysis revealed a distinct signature of NSCLC tumor repression, suggesting a lung multilineage lung dedifferentiation, along with an upregulated signature associated with RET^C634Y mutation, potentially linked to poor NSCLC prognosis. These findings were validated using the RET^C634Y knock-in iPSC model, highlighting key cancerous targets such as PROM2 and C1QTNF6, known to be associated with poor prognostic outcomes. Furthermore, the LPCs derived from RET^C634Y iPSCs exhibited a positive response to the RET inhibitor pralsetinib, evidenced by the downregulation of the cancer markers. This study provides a novel patient-derived off-the-shelf iPSC model of RET-driven NSCLC, paving the way for exploring the molecular mechanisms involved in RET-driven NSCLC to study disease progression and to uncover potential therapeutic targets.

Purpose: To model CML progression in vitro and generate a blast crisis (BC-CML) model in vitro in order to identify new targets. Methods: Three different CML-derived iPSC lines were mutagenized with the alkylating agent ENU on a daily basis for 60 days. Cells were analyzed at D12 of hematopoietic differentiation for their phenotype, clonogenicity, and transcriptomic profile. Single-cell RNA-Seq analysis has been performed at three different time points during hematopoietic differentiation in ENU-treated and untreated cells. Results: One of the CML-iPSCs, compared to its non-mutagenized counterpart, generated myeloid blasts after hematopoietic differentiation, exhibiting monoblastic patterns and expression of cMPO, CD45, CD34, CD33, and CD13. Single-cell transcriptomics revealed a delay of differentiation in the mutated condition as compared to the control with increased levels of MSX1 (mesodermal marker) and a decrease in CD45 and CD41. Bulk transcriptomics analyzed along with the GSE4170 GEO dataset reveal a significant overlap between ENU-treated cells and primary BC cells. Among overexpressed genes, CD25 was identified, and its relevance was confirmed in a cohort of CML patients. Conclusions: iPSCs are a valuable tool to model CML progression and to identify new targets. Here, we show the relevance of CD25 identified in the iPSC model as a marker of CML progression.

Bispecific antibodies (bsAbs) such as glofitamab represent a promising therapeutic approach for relapsed/refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma (R/R B-NHL), but resistance mechanisms remain poorly understood. This study aimed to identify predictive markers of bsAb resistance based on the response of 3-dimensional patient-derived lymphoma spheroids (PDLS) established from 39 R/R B-NHL samples. PDLS were treated with glofitamab for 3 days, and B-cell depletion was quantified to assess the ex vivo treatment response. Comprehensive immune profiling was performed on patient samples using multiparametric flow cytometry, single-cell RNA sequencing, codetection by indexing spatial proteomics, and functional assays. High responders to glofitamab possessed CD8+ T cells with consistently higher cytotoxic and activation signatures across effector differentiation states, whereas low responders showed enrichment of exhausted CD8+ T cells with enhanced expression of exhaustion markers (T-cell immunoglobulin and ITIM domain [TIGIT], LAG3, and PD1). Furthermore, low responders exhibited elevated functional CD4+ T follicular helper (Tfh) cells in close proximity to malignant B cells, thus promoting their survival through interleukin-21 and C-X-C motif chemokine ligand 13 signaling pathways. Analysis of pretreatment RNA-sequencing data from 48 patients with R/R B-NHL confirmed that high Tfh cell abundance is associated with poor glofitamab response. In PDLS, anti-TIGIT cotreatment enhanced glofitamab efficacy in low responders, and Tfh cell depletion experiments confirmed that reducing Tfh cell activity increased B-cell depletion. Together, these findings identify CD8+ T-cell exhaustion and functionally activated Tfh cells as key factors associated with glofitamab resistance in R/R B-NHL. This work supports their potential use as predictive biomarkers for selecting patients with higher probability of response and provides a foundation for future combination therapeutic strategies.

Introduction: Previous studies have suggested that the tyrosine kinase receptor RET plays a sig-nificant role in the hematopoietic potential in mice and could also be used to expand cord-blood derived hematopoietic stem cells (HSCs). The role of RET in the human iPSC-derived hematopoi-esis has not been tested so far. Methods: To test the implication of RET on the hematopoietic potential of iPSCs, we activated its pathway with the lentiviral overexpression of RETWT or RETC634Y mutation in normal iPSCs. An iPSC derived from a patient harboring the RETC634Y mutation (iRETC634Y) and its CRISPR-corrected isogenic control iPSC (iRETCTRL) were also used. Hematopoietic potential was tested using 2D cul-tures and evaluated regarding the phenotype and the clonogenic potential of generated cells. Results: Hematopoietic differentiation from iPSCs with RET overexpression (WT or C634Y) led to a significant reduction in the number and in the clonogenic potential of HSCs (CD34+/CD38-/CD49f+) as compared to control iPSCs. Similarly, the hematopoietic potential of iRETC634Y was reduced as compared to iRETCTRL. Transcriptomic analyses revealed a specific ac-tivated expression profile for iRETC634Y compared to its control with evidence of overexpression of genes which are part of the MAPK network with negative hematopoietic regulator activities. Conclusion: RET activation in iPSCs is associated with an inhibitory activity in iPSC-derived hematopoiesis, potentially related with MAPK activation.

Cellules souches pluripotentes induites (CSPi) exprimant RET pour la modélisation de l'hématopoïèse et du cancer du poumon non-à petites cellules: Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont générées en reprogrammant des cellules adultes pour les ramener à un état semblable à l'état embryonnaire. Les CSPi ont la capacité de se différencier en divers types de cellules, ce qui en fait des outils précieux pour la médecine régénératrice, la modélisation des maladies et la découverte de médicaments.Lorsqu'un gène « driver » a été identifié dans le cas d'une maladie monogénique ou maligne, il est possible d'utiliser à la fois une CSPi dérivée d'un patient et de générer une CSPi isogénique contrôle pour identifier les caractéristiques spécifiques liées à la mutation. Nous avons utilisé cette stratégie pour étudier l'effet du gène REarranged during Transfection (RET), un récepteur de tyrosine kinase, au cours de la différenciation des CSPi dans deux contextes. Nous avons d'abord étudié le rôle potentiel de RET dans l'induction des cellules hématopoïétiques. Dans la deuxième partie, l'objectif était de reproduire un carcinome pulmonaire malin in vitro en générant des cellules progénitrices pulmonaires (CPP) et des organoïdes à partir de ces CSPi. Pour répondre à ces deux objectifs, nous avons utilisé des CSPi dérivées d'un patient porteur de la mutation somatique RETC634Y (iRETC634Y), causant l'autophosphorylation de la protéine RET et donc l'activation constitutive de sa voie de signalisation. Nous avons complété nos études avec la génération d'une CSPi RETC634Y knock-in (PB68-RETC634Y).Dans la première partie de ce manuscrit, nous avons étudié le rôle RET dans l'hématopoïèse dérivée des CSPi en utilisant des stratégies d'induction hématopoïétique in vitro permettant de générer de manière reproductible des cellules hématopoïétiques avec les marqueurs de CSH. Les CSPi témoins ont été comparées aux CSPi exprimant la version mutée de RET. Les analyses transcriptomiques ont révélé un profil d'expression spécifique dans les cellules hématopoïétiques dérivées de la CSPi iRETC634Y, comprenant la surexpression de gènes associés à la voie des MAPKs et de protéines régulant négativement l'hématopoïèse. Ces résultats suggèrent que l'activation de RET pourrait être associée à un effet inhibiteur sur l'hématopoïèse dérivée des CSPi, potentiellement par l'activation de la voie des MAPKs.Dans la deuxième partie de ce travail, nous nous sommes demandé si nous pouvions générer de manière reproductible des CPP à partir de CSPi dérivées de patients porteurs de la mutation somatique RETC634Y. Nous avons utilisé un protocole de 16 jours dans le but de générer un des progéniteurs pulmonaires pouvant reproduire un modèle de carcinome pulmonaire non à petites cellules (CPNPC) lié à l'activation de la protéine RET. En effet, les réarrangements oncogéniques de RET peuvent survenir dans 1 à 2% des adénocarcinomes pulmonaires et seuls quelques modèles d'études pour cette maladie sont disponibles. Nous avons généré des CPP exprimant les marqueurs caractéristiques des progéniteurs pulmonaires. Les CPP dérivées de CSPi porteur de la mutation RETC634Y ont montré une surexpression de marqueurs associés au cancer par rapport aux CSPi témoins. L'analyse transcriptomique a révélé des signatures distinctes indiquant une dédifférenciation pulmonaire dans les tumeurs CPNPC, ainsi qu'une signature suractivée associée à la mutation RETC634Y, potentiellement liée à des mauvais pronostics de CPNPC. Les résultats ont été validés ultérieurement en utilisant le modèle de CSPi où la mutation RETC634Y avait été knock-in, mettant en évidence les marqueurs de cancer PROM2 et C1QTNF6, connus pour leur association avec des pronostics défavorables. De plus, les CPP dérivées de CSPi porteur de la mutation RETC634Y ont montré une réponse positive à l'inhibiteur de RET, le Pralsetinib, comme en témoigne la régulation à la baisse des marqueurs de cancer. Cette étude établit le premier modèle de CPNPC lié à l'activation de l'oncogène RET généré à partir de CSPi dérivées de patients.