Dans le domaine aéronautique, où la sécurité constitue une priorité absolue, la performance des pilotes dépend fortement de leur capacité à gérer efficacement leur charge de travail mental (CTM). Cette dernière, reconnue comme un facteur contributif dans de nombreux accidents, suscite une attention croissante de la part des acteurs du secteur : agences réglementaires, autorités nationales, industriels et chercheurs. Le suivi en temps réel de la CTM représente ainsi un enjeu majeur pour anticiper les situations à risque et renforcer la sécurité des opérations. Diverses méthodes d’évaluation de la CTM ont été développées. Certaines reposent sur la mesure de la performance, impliquant une modulation volontaire de celle-ci pour en extraire des informations pertinentes. D'autres s'appuient sur l’auto-évaluation subjective, mais nécessitent généralement l’interruption de la tâche en cours, ce qui limite leur applicabilité en environnement opérationnel. Une alternative prometteuse consiste à exploiter les bio signaux périphériques, permettant d’estimer l’état psychophysiologique de l’opérateur sans perturber son activité. Ce travail de thèse s’est concentré sur l’utilisation de deux bio signaux en particulier : l’activité électrodermale (EDA) et la variabilité du rythme cardiaque (VRC). Les marqueurs traditionnels issus de ces bio signaux, fondés sur des analyses temporelles ou fréquentielles, se révèlent souvent insuffisamment sensibles pour détecter des variations fines de la CTM. De plus, les contraintes liées aux sites de mesure classiques de l’EDA (paumes ou doigts) limitent son exploitation en environnement complexe. Plus récemment, l’émergence d’approches temps-fréquence, combinée aux évolutions technologiques, a ouvert de nouvelles perspectives pour l’utilisation de ces bio signaux dans la caractérisation de la CTM en environnement opérationnel. Dans ce contexte, ce travail de thèse a consisté à démontrer l’intérêt des marqueurs temps fréquences issus des bio signaux d’EDA et de VRC pour la caractérisation et la différenciation des niveaux de CTM. Il a également contribué à valider un site de mesure alternatif pour l’EDA, compatible avec les contraintes spécifiques du domaine aéronautique, offrant ainsi des perspectives concrètes pour le développement de dispositifs adaptés. Enfin, la robustesse des marqueurs temps fréquence à la présence d’une dette de sommeil a été confirmée, renforçant leur pertinence pour un suivi fiable de la CTM dans des contextes réalistes et contraints. Ces avancées ouvrent la voie à l’intégration de systèmes multi capteurs, non intrusifs et performants, dédiés à la surveillance continue de la CTM en environnement opérationnel.