Diagnostics often require specialized equipment and trained personnel in laboratory settings, creating a growing need for point-of-care tests (POCTs). Among the genetic testing methods available, Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) offers a viable solution for developing genetic POCT due to its compatibility with simplified devices. This study aimed to create a genetic test that integrates all steps from sample processing to analyzing results while minimizing the complexity, handling, equipment, and time required. Several challenges were addressed to achieve this goal: (1) the development of a buffer for bacterial DNA extraction that is compatible with both LAMP and immunochromatographic tests; (2) the adaption of the LAMP protocol for use with the SPID device; and (3) the optimization of the detection protocol for specific test conditions, with a lateral flow immunoassay format selected for its POCT compatibility. Following these developments, the test was validated using Escherichia coli (E. coli) and non-E. coli strains. A portable heating station was also developed to enable amplification without costly equipment. The resulting genetic POCT achieved 100% sensitivity and 85% specificity, with results available in 60 to 75 min. This study demonstrated that our POCT efficiently performs DNA extraction, amplification, and detection for bacterial identification. The test’s simplicity and cost-effectiveness will support its implementation in various settings.

La bio-analyse correspond à l'identification et la quantification des molécules biologiques ou activement biologiques dans un échantillon. Elle se divise en plusieurs étapes : la collecte de l'échantillon et l'envoi au laboratoire ; la préparation des échantillons qui permet de le rendre compatible à la méthode d'analyse ; l'analyse et enfin la mesure des événements ayant eu lieu pendant l'analyse.Au cours de cette thèse, deux types d'analyse ont été étudiées : la spectrométrie de masse, plus particulièrement le MALDI-TOF, et une PCR isotherme nommée amplification isotherme médiée par les boucles (LAMP).L'objectif principale de la thèse était de rendre compatible ces méthodes d'analyse à une utilisation terrain. Pour cela, le SPID, un dispositif breveté par le CEA, a été adapté à ces deux technologies. Ce dispositif permet la filtration, la concentration, l'extraction d'une suspension bactérienne et la détection par immunochromatographie à flux latéral. Le SPID est un outil qui permet de s'affranchir des étapes de centrifugations ou lavages, méthodes classiquement utilisées pour préparer les échantillons pour le MALDI et la LAMP.Pour extraire les protéines ribosomales, pour une analyse au MALDI-TOF, il a fallu développer un tampon d'extraction compatible avec une telle analyse. En effet, pour faciliter la lyse bactérienne, l'utilisation de détergents est souvent recommandée ; or, les détergents peuvent empêcher l'identification des bactéries en spectrométrie de masse. Les résultats ont été comparés avec un protocole de référence proposé par Bruker. L'utilisation du SPID a permis d'identifier trois espèces bactériennes à une concentration de 107 UFC/mL dans un milieu simple et en urine. Le protocole de référence, quant à lui, a permis ces mêmes identifications à une concentration de 106 UFC/mL.Pour extraire l'ADN des bactéries avec le SPID suivi d'une amplification LAMP, de nombreuses mises au point ont été faites. Après avoir implanté la technique au laboratoire, différentes méthodes d'extraction avec le SPID ont été développées. Celle qui permet d'obtenir les meilleurs résultats est la création d'un tampon d'extraction combiné aux réactifs nécessaires à la LAMP. L'autre méthode étudiée est l'utilisation de billes de silice pour purifier l'ADN avant la réaction d'amplification.Pour rendre le chauffage compatible à une utilisation terrain, une station de chauffage a été conçue au cours de la thèse. Cette station permet de chauffer le réservoir du SPID pendant 40 minutes à 65 °C. Elle pourrait être alimentée par batterie.La détection des produits de l'amplification, appelés amplicons, est faite par immunochromatographie à flux latéral. Les amplicons sont marqués à leurs extrémités grâce à deux amorces. Une des amorces est marquée à la digoxigénine, l'autre à la biotine. L'amplicon est capturé par un anti-anticorps anti-digoxigénine, immobilisé sur une membrane de nitrocellulose, et est révélé à l'aide de la streptavidine couplé à des nanoparticules d'or.Avec les différents éléments développés au cours de cette thèse, le protocole pour réaliser une LAMP sur le terrain dure moins d'une heure : de la préparation des échantillons à la détection.

Diagnostics often require specialized equipment and trained personnel in laboratory settings, creating a growing need for point-of-care tests (POCT). Among genetic testing methods, Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) offers a viable solution for developing genetic POCT due to its compatibility with simplified devices. This study aimed to create a genetic test that integrates all steps from sample processing to results while minimizing the complexity, handling, equipment, and time required. Several challenges were addressed to achieve this goal: 1) Developing a buffer for bacterial DNA extraction that is compatible with both LAMP and immunochromatographic tests; 2) Adapting the LAMP protocol for its use with the device; and 3) Optimizing the detection protocol for specific test conditions, with a lateral flow immunoassay format selected for its POCT compatibility. Following these developments, the test was validated using Escherichia coli and non-E. coli strains. A portable heating station was also developed to enable amplification without costly equipment. The resulting genetic POCT achieved 100% sensitivity and 85% specificity, with results available in 60 to 75 minutes. This study demonstrated that our closed-method POCT efficiently performs DNA extraction, amplification, and detection for bacterial identification. The test’s simplicity and cost-effectiveness will support its implementation in various settings.