The significant accumulation of protein-rich agro-industrial waste requires the urgent development of biotechnological methods for its processing and usage. Strains of B. subtilis and B. paralicheniformis were isolated and identified from soil samples obtained from a chicken farm in the Akmola region and the city of Taraz. These strains produce proteases with peak activity at 70 °C and pH 10.5 for B. subtilis, and at 60 °C and pH 9.0 for B. paralicheniformis. The protease, keratinase, and collagenase activity of B. subtilis enzymes are 158.8 ± 2.5 U/mL, 109.3 U/mL, and 10.4 U/mL, respectively. The enzyme values for B. paralicheniformis were 323 ± 4.8 U/mL, 122.6 U/mL, and 23.6 U/mL, respectively. Enzymatic hydrolysis of poultry and livestock waste, including chicken feathers, hooves, and cattle hides, was conducted using the B. paralicheniformis strain. Following 96 hours of treatment, the hydrolysis rates of feathers, hooves, and hides were 100%, 29.6%, and 97.2%, respectively. Examination of the hydrolyzed feathers using scanning electron microscopy revealed the degradation of essential structural components of the feathers and the adherence of bacterial cells to the surface of the feather keratin. The acquired data suggest the potential of the B. paralicheniformis strain as a producer of alkaline proteolytic enzymes and its use in technologies for processing protein-rich agro-industrial waste.

Phytases are industrial enzymes that enhance the availability of phytate-bound phosphorus and can reduce the environmental burden associated with undigested phytate. Bacillus paralicheniformis T7 is a spore-forming strain exhibiting multiple hydrolytic activities, including phytase activity. The phyL gene encoding β-propeller phytase was cloned from B. paralicheniformis T7 and expressed in Escherichia coli, followed by purification and biochemical characterization of the recombinant enzyme—rPhyL. The molecular mass of rPhyL was 41.0 kDa, and maximal activity was observed at pH 8.0 and 60 °C. The enzyme displayed alkaline stability, retaining 90% and 93% of its initial activity after 5 h at pH 8.0 and 10.0, respectively. Following 5 h of incubation at 50 °C and 55 °C, residual activities were 83% and 46%, respectively. rPhyL was strongly Ca²⁺-dependent, with maximal activity at 0.6–1.0 mM CaCl₂. Kinetic analysis using sodium phytate as the substrate yielded an apparent K_m of 1.21 mM, an apparent V_max of 328.6 μM·min⁻¹, and an apparent K_i of 1.34 mM under the specified assay conditions. Under the tested conditions, rPhyL exhibited detectable activity toward sodium phytate, whereas no detectable activity was observed toward ATP, sodium pyrophosphate, β-glycerophosphate, or p-nitrophenyl phosphate. These findings characterize rPhyL as a Ca²⁺-dependent bacillary β-propeller phytase with alkaline stability, expanding the enzymatic repertoire of the spore-forming B. paralicheniformis T7 strain.

Протеазы являются ферментами, гидролизующими белки по пептидным связям, и классифицируются на семейства сериновых, цистеиновых, аспартатных и металлопротеаз. Протеазы, в особенности, микробиального происхождения используются в различных отраслях человеческой деятельности. Штаммы-продуценты бациллярных протеаз способны расти на недорогих питательных средах, что имеет немаловажное значение для индустрии. Целью работы являлось получение рекомбинантных металлопротеаз М14 и М42 бацилярного происхождения и изучение их свойств. На основании последовательности генома штамма Bacillus paralicheniformis (GenBank NCBI под номером доступа CP124861) подобраны праймеры для клонирования генов металлопротеаз М14 и М42 с молекулярными массами 60,6 кДа и 38,2 кДа, соответственно. Гены были клонированы в составе бактериального экспрессионного вектора рЕТ-28с(+) по сайтам BamHI и XhoI и встроены под контроль промотора Т7. Биоинформатический анализ показал, что металлопротеаза М14 содержит сигнальный пептид MNIQKRVQALLAAAAMFAGLMVSDAVHA, который был удален при клонировании. Путем плазмидной экспрессии в штамме Escherichia coli ArcticExpress(DE3)RP получены рекомбинантные белки rМ14 и rМ42. Индукцию для гетерологичной экспрессии осуществляли путем добавления 0,5 мМ изопропил-β-тиогалактопиранозида. Очистку rМ14 и rМ42 из бактериального лизата осуществляли методом металлоаффинной хроматографии с использованием Ni-NTA сорбента. Очищенный рекомбинантные белки были диализованы на мембране с порогом отсечения 14 кДа. Выход рекомбинантных белков rМ14 и rМ42 составил 27,5 мг и 1,67 мг с 1 литра индуцированной культуры, соответственно. Изучение биохимических свойств показало, что металлопротеазы rМ14 и rМ42 активны при 50°С в буфере Tris-HCl с рН 7,0. Зимографический анализ на казеине, сополимеризованным с полиакриламидным гелем подтвердил протеолитическую активность rМ14 и rМ42. Полученными рекомбинантными белками были иммунизированы кролики. Иммунизацию проводили в течение 1 месяца. После подтверждения иммунного ответа, была получена сыворотка, из которой были выделены антитела анти-rM14 и анти-rM42 путем высаливания сульфатом аммония с последующим диализом. С помощью данных антител методом вестерн-блоттинга была проверена секреция металлопротеаз М14 и М42 в энзиматическом экстракте, полученном путем культивирования нативного штамма Bacillus paralicheniformis на перьевой среде. Установлено, что в энзиматическом экстракте штамма Bacillus paralicheniformis присутствует металлопротеаза М14 и отсутствует М42, что можно объяснить определяющей ролью сигнального пептида. В дальнейшем будет продолжено изучение металлопротеаз rМ14 и rМ42, а полученные антитела rM14 и анти-rM42 будут использованы для определения уровня накопления нативных металлопротеаз в секреторной и внутриклеточной протеоме протеолитических штаммов рода Bacillus при их культивировании на различных субстратах.

In the present study, two metalloproteases M14 and M42 from a Kazakh strain of Bacillus paralicheniformis T7 with high proteolytic activity were successfully cloned, expressed and purified. Protease genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers selected on the basis of full genome sequencing data of B. paralicheniformis strain N7 (GenBank accession #CP124861). The amplified fragments were cloned in the expression vector pET-28c(+). Recombinant analogs of the metalloproteases M14 and M42 were obtained by plasmid expression in Escherichia coli cells of the strain ArcticExpressRP(DE3). Using metal affinity chromatography, rM14 and rM42 proteins were purified and polyclonal antibodies were produced by immunization of rabbits. Using anti-rM14 and anti-rM42 antibodies, the expression level of native metalloproteases M14 and M42 in cell lysate and culture fluid of B. paralicheniformis T7 strain was examined after culturing the strain on keratin-containing media: chicken feather, horn, hoof, hide and wool of cattle. Substrate-dependent expression of metalloprotease genes of B. paralicheniformis strain T7 was established. The obtained results indicate the prospective use B. paralicheniformis strain T7 as a producer of metalloproteases M14 and M42.