Escherichia coli excretes acetate upon growth on fermentable sugars, but the regulation of this production remains elusive. Acetate excretion on excess glucose is thought to be an irreversible process. However, dynamic ¹³C-metabolic flux analysis revealed a strong bidirectional exchange of acetate between E. coli and its environment. The Pta-AckA pathway was found to be central for both flux directions, while alternative routes (Acs or PoxB) play virtually no role in glucose consumption. Kinetic modelling of the Pta-AckA pathway predicted that its flux is thermodynamically controlled by the extracellular acetate concentration in vivo. Experimental validations confirmed that acetate production can be reduced and even reversed depending solely on its extracellular concentration. Consistently, the Pta-AckA pathway can rapidly switch from acetate production to consumption. Contrary to current knowledge, E. coli is thus able to co-consume glucose and acetate under glucose excess. These metabolic capabilities were confirmed on other glycolytic substrates which support the growth of E. coli in the gut. These findings highlight the dual role of the Pta-AckA pathway in acetate production and consumption during growth on glycolytic substrates, uncover a novel regulatory mechanism that controls its flux in vivo, and significantly expand the metabolic capabilities of E. coli.

Networks of molecular chaperones maintain cellular protein homeostasis by acting at nearly every step in the biogenesis of proteins and protein complexes. Herein, we demonstrate that the major chaperone DnaK/HSP70 of the model bacterium Escherichia coli is critical for the proper functioning of the central metabolism and for the cellular response to carbon nutrition changes, either directly or indirectly via the control of the heat-shock response. We identified carbon sources whose utilization was positively or negatively affected by DnaK and isolated several central metabolism genes (among other genes identified in this work) that compensate for the lack of DnaK and/or DnaK/Trigger Factor chaperone functions in vivo. Using carbon sources with specific entry points coupled to NMR analyses of real-time carbon assimilation, metabolic coproducts production and flux rearrangements, we demonstrate that DnaK significantly impacts the hierarchical order of carbon sources utilization, the excretion of main coproducts and the distribution of metabolic fluxes, thus revealing a multilevel interaction of DnaK with the central metabolism.

We have developed a robust workflow to measure high-resolution fluxotypes (metabolic flux phenotypes) for large strain libraries under fully controlled growth conditions. This was achieved by optimizing and automating the whole high-throughput fluxomics process and integrating all relevant software tools. This workflow allowed us to obtain highly detailed maps of carbon fluxes in the central carbon metabolism in a fully automated manner. It was applied to investigate the glucose fluxotypes of 180 Escherichia coli strains deleted for y-genes. Since the products of these y-genes potentially play a role in a variety of metabolic processes, the experiments were designed to be agnostic as to their potential metabolic impact. The obtained data highlight the robustness of E. coli’s central metabolism to y-gene deletion. For two y-genes, deletion resulted in significant changes in carbon and energy fluxes, demonstrating the involvement of the corresponding y-gene products in metabolic function or regulation. This work also introduces novel metrics to measure the actual scope and quality of high-throughput fluxomics investigations.

Mécanismes métaboliques adaptatifs aux contraintes nutritionnelles et génétiques chez Escherichia coli: Les micro-organismes, tels que les bactéries, possèdent d’importantes capacités à moduler leur métabolisme pour répondre à des perturbations environnementales physico-chimiques (température, pH, O2, etc.) et/ou nutritionnelles (carbone, azote, oligoéléments, etc.), mais également à des modifications naturelles (évolution, acquisition transversale de gènes, mutation spontanée, etc.) ou synthétiques (ingénierie métabolique) de leur génome. Comprendre ces mécanismes d’adaptation est fondamental pour appréhender les interactions complexes qu’il existe entre les micro-organismes au sein des consortia, entre les micro-organismes et leur niche écologique, ou bien optimiser la production industrielle de molécules à haute valeur ajoutée en biotechnologie.Au cours de ce travail de thèse, le métabolisme de la bactérie Escherichia coli K-12 MG1655 a fait l’objet d’une étude approfondie visant à mieux comprendre comment celui-ci permet à la bactérie de s’adapter à différentes contraintes. La première est nutritionnelle. En présence de plusieurs sources de carbone (glucose et acétate), il a été mis en évidence une consommation simultanée de ces deux sources de carbone lors d'une croissance exponentielle sur un excès de glucose, contrairement à ce qui est généralement considéré pour ce microorganisme. Les données obtenues montrent aussi que la voie Pta-AckA seule est capable de soutenir à la fois la production et la consommation d'acétate en cas d'excès de glucose. La carence en fer, un oligoélément essentiel pour la bactérie a aussi été étudiée et comparée au taxon « B2 » qui regroupe des E. coli dites commensales mais aussi pathogènes. Les résultats démontrent une grande disparité entre les souches K12 et B2 ; ces dernières résistant mieux à des carences en fer. Une similitude métabolique a pu être observée puisque les premières enzymes métaboliques impactées sont localisées dans la voie des acides aminés branchés.Enfin, une contrainte métabolique résultant d’une mutation génétique localisée dans le gène ilvG des souches E. coli K-12 MG1655 a été étudiée. Il s’agit d’un gène codant pour une enzyme de voies métaboliques complexes et centrales pour la biosynthèse des acides aminés branchés (valine, leucine et isoleucine). Ces derniers représentent 20% de la composition des protéines en acides aminés. Cette étude s’est appuyée sur des approches quantitatives de métabolomique et de fluxomique pour l’analyse fonctionnelle des réseaux métaboliques basées essentiellement sur la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire (RMN). Des méthodologies de RMN dédiées à ce type d’approches ont été développées au cours de ce travail de thèse. L’ensemble des résultats obtenus sur ce volet a permis d’apporter de nouvelles connaissances sur le fonctionnement de la voie des acides aminés branchés en particulier, et sur les mécanismes de sa régulation. Décrite comme dépendante des concentrations en valine, leucine et isoleucine, sa régulation est en fait bien plus complexe. D’autres mécanismes de contrôle métabolique, mis en évidence au cours de la thèse (excrétion du propionate, activité promiscuitaire des AHAS) contribuent également au maintien de l’homéostasie dans cette partie du métabolisme.