The liver is a very complex organ that ensures numerous functions; it is thus susceptible to multiple types of damage and dysfunction. Since 1983, orthotopic liver transplantation (OLT) has been considered the only medical solution available to patients when most of their liver function is lost. Unfortunately, the number of patients waiting for OLT is worryingly increasing, and extracorporeal liver support devices are not yet able to counteract the problem. In this review, the current and expected methodologies in liver regeneration are briefly analyzed. In particular, human pluripotent stem cells (hPSCs) as a source of hepatic cells for liver therapy and regeneration are discussed. Principles of hPSC differentiation into hepatocytes are explored, along with the current limitations that have led to the development of 3D culture systems and organoid production. Expected applications of these organoids are discussed with particular attention paid to bio artificial liver (BAL) devices and liver bio-fabrication.

Melanoma cell sensitivity to targeted therapy molecules is dependent on the tumor microenvironment (cell-cell and cell-extracellular matrix interactions). Three dimensional (3D) in vitro cell culture systems better reflect the native structural architecture of tissues and are attractive to investigate cellular interactions. We have developed and compared several metastatic melanoma models: melanoma cells (SK-MEL-28 and SK-MEL-3, BRAF V600E mutant and SK-MEL-2 BRAF wt) cultured as a monolayer (2D) and co-cultured on 3D dermal equivalents with fibroblasts to better unravel factors modulating cell sensitivity to a BRAF inhibitor (BRAFi, vemurafenib). Cell sensitivity to treatments was evaluated under various aspects: cell proliferation (cell counting, EdU incorporation, MTS assay), MAPK and PKB/Akt signaling pathway analysis (Western-blotting), apoptosis (TUNEL), cytokine and growth factor release (ELISA) and histology (3D models). SK-MEL-28 and SK-MEL-3 cell proliferation inhibition upon BRAFi treatment was observed in both models, without apoptosis induction. SK-MEL-2 cell line was clearly resistant to BRAFi when cultured as a monolayer but not when co-cultured with 3D fibroblasts embedded in a type I collagen matrix. Conditioned-media provided by 3D fibroblasts (dermal equivalents) underlined 2D SK-MEL-2 sensitivity to BRAFi. Cell culture supernatant analysis revealed that dermal equivalents released some soluble factors (IL-6, IL-8, HGF, TGF-β): these secretions were modified during vemurafenib treatment. The heterotypic 3D melanoma model we have established summarizes paracrine signalization by stromal cells and type I collagen matrix, mimicking the natural microenvironment of cutaneous metastatic melanoma. This model could be a powerful tool for predicting drug efficiency.

Liver cell therapy and in vitro models require functional human hepatocytes, the sources of which are considerably limited. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent a promising and unlimited source of differentiated human hepatocytes. However, when obtained in two-dimensional (2D) cultures these hepatocytes are not fully mature and functional. As three-dimensional culture conditions offer advantageous strategies for differentiation, we describe here a combination of three-dimensional (3D) approaches enabling the successful differentiation of functional hepatocytes from hiPSCs by the encapsulation of hiPSC-derived hepatoblasts in alginate beads of preformed aggregates. The resulting encapsulated and differentiated hepatocytes (E-iHep-Orgs) displayed a high level of albumin synthesis associated with the disappearance of α-fetoprotein (AFP) synthesis, thus demonstrating that the E-iHep-Orgs had reached a high level of maturation, similar to that of adult hepatocytes. Gene expression analysis by RT-PCR and immunofluorescence confirmed this maturation. Further functional assessments demonstrated their enzymatic activities, including lactate and ammonia detoxification, as well as biotransformation activities of Phase I and Phase II enzymes. This study provides proof of concept regarding the benefits of combining three-dimensional techniques (guided aggregation and microencapsulation) with liver differentiation protocols as a robust approach to generate mature and functional hepatocytes that offer a permanent and unlimited source of hepatocytes. Based on these encouraging results, our combined conditions to produce mature hepatocytes from hiPSCs could be extended to liver tissue engineering and bioartificial liver (BAL) applications at the human scale for which large biomasses are mandatory.

Pour faire face à la pénurie de foies transplantables, des dispositifs extracorporels connus sous le nom de foie bioartificiel (BAL) ont été développés. Ces dispositifs nécessitent une importante biomasse hépatique fonctionnelle, sous une forme qui maintient la viabilité et les fonctions cellulaires. Les hépatocytes primaires humains (PHH) sont considérés comme la source cellulaire idéale. Néanmoins, la disponibilité de ces cellules est restreinte et elles perdent rapidement leur fonctionnalité in vitro, ce qui limite fortement leur utilisation. Dans ce contexte, les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) représentent une alternative prometteuse pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice, grâce à leur capacité d'auto-renouvèlement et leur potentiel de différentiation en tout type de cellule, y compris les hépatocytes.Le projet de la thèse était d'évaluer le potentiel des hépatocytes différenciés à partir d'hiPSC (iHep) comme alternative aux PHH dans le BAL conçu au laboratoire de Biomécanique et Bioingénierie de l'UTC (BMBI- UMR CNRS 7338). A cette fin, au sein du laboratoire UMR_S1193 (INSERM - Université Paris-Saclay), nous avons optimisé les conditions de culture et d'encapsulation des iHep dans le but de produire des hépatocytes matures et pleinement fonctionnels. En effet, dans le BAL, un bioréacteur permet la perfusion des hépatocytes encapsulés en billes d'alginate pour les protéger des forces de cisaillement.Dans un premier temps, les hiPSC ont été différenciées en hépatoblastes (iHB), progéniteurs des hépatocytes qui ont été encapsulés en billes d'alginate pour la suite de la différenciation en hépatocytes. Cette démarche visait à combiner le protocole précédemment mis en place dans le BAL avec des cellules HepaRG et celui de la différenciation des hiPSC en hépatocytes. Toutefois, encapsulés en tant que cellules isolées et à faible densité, les iHB ne sont pas capables de s'auto-agréger dans les billes. Encapsulés en utilisant des densités cellulaires plus élevées, les iHB forment des agrégats, mais ils s'échappent des billes d'alginate et la différenciation des cellules n'y est plus contrôlée.Dans un deuxième temps, nous avons favorisé l'auto-agrégation des iHB en micropuits avant de les encapsuler dans l'alginate. Nos données ont démontré que l'encapsulation des agrégats préformés n'affectait ni la viabilité cellulaire ni la différenciation en hépatocytes. L'analyse des fonctions hépatocytaires des agrégats encapsulés (synthèse de l'albumine, détoxification du lactate et de l'ammoniaque, biotransformation enzymatique) a montré un niveau bien supérieur à celui des iHep cultivés en 2D (système utilisé comme contrôle) et très proche de celui des agrégats non encapsulés.Finalement, nous avons mis au point un nouveau système de production des agrégats iHB sous agitation orbitale continue en vue de la production à grande échelle des iHep. Ces agrégats, encapsulés et différenciés en iHep suivant le protocole établi précédemment, ont montré les mêmes fonctions hépatocytaires que ceux obtenus par la technique des micropuits.Ce travail démontre le potentiel d'utilisation des iHep comme source cellulaire renouvelable d'hépatocytes humains et en particulier comme composant biologique du BAL avec des protocoles d'agrégation et d'encapsulation qui sont simples à mettre en œuvre et à changer d'échelle, pour produire une biomasse suffisante à la suppléance hépatique.