The chick chorioallantoic membrane (CAM), as an extraembryonic tissue layer generated by the fusion of the chorion with the vascularized allantoic membrane, is easily accessible for manipulation. Indeed, grafting tumor cells on the CAM lets xenografts/ovografts develop in a few days for further investigations. Thus, the CAM model represents an alternative test system that is a simple, fast, and low-cost tool to study tumor growth, drug response, or angiogenesis in vivo. Recently, a new era for the CAM model in immune-oncology-based drug discovery has been opened up. Although there are many advantages offering extraordinary and unique applications in cancer research, it has also disadvantages and limitations. This review will discuss the pros and cons with experts in the field.

(1) Purpose: To assess the use of the chicken embryo (in ovo) model as an alternative in vivo model for immuno-oncology (IO) drug development, focusing on programmed cell death protein-1 (PD-1)/programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) immune checkpoint inhibitors. (2) Methods: First, the presence of immune cells in the model was detected through the immunophenotyping of chicken peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) based on fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis and the immunohistochemistry (IHC) analysis of in ovo tumor-infiltrating lymphocytes. Second, the cross-reactivity between one anti-human PD-1 Ab, pembrolizumab (KEYTRUDA^®), and chicken PD-1 was verified through the labelling of chicken splenocytes with pembrolizumab by FACS analysis. Third, the blockade effect of pembrolizumab on chicken PBMCs was assessed in vitro through cytotoxicity assay based on MTT. Fourth, the CAM assay was used to estimate the anti-tumor performance of pembrolizumab through the analyses of tumor growth and chicken immune cell infiltration in tumors. Finally, the efficacy of several PD-1 or PD-L1 inhibitors (nivolumab, atezolizumab and avelumab) on tumor growth was further assessed using the CAM assay. (3) Results: The presence of CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ T lymphocytes and monocytes was confirmed by FACS and IHC analyses. During in vitro assays, pembrolizumab cross-reacted with chicken lymphocytes and induced PD-1/PD-L1 blockade, which permitted the restoration of chicken T-cell’s cytotoxicity against human lung cancer H460 tumor cells. All these in vitro results were correlated with in ovo findings based on the CAM assay: pembrolizumab inhibited H460 tumor growth and induced evident chicken immune cell infiltration (with significant chicken CD45, CD3, CD4, CD8 and CD56 markers) in tumors. Furthermore, the potency of the CAM assay was not limited to the application of pembrolizumab. Nivolumab, atezolizumab and avelumab also led to tumor growth inhibition in ovo, on different tumor models. (4) Conclusions: The chicken embryo affords a physiological, immune reactive, in vivo environment for IO research, which allows observation of how the immune system defense against tumor cells, as well as the different immune tolerance mechanisms leading to tumor immune escape. The encouraging results obtained with PD-1/PD-L1 inhibitors in this study reveal the potential use of the chicken embryo model as an alternative, fast, and reliable in vivo model in the different fields of IO drug discovery.

Immunotherapies have significantly improved the prognosis of patients with advanced hepatocellular carcinoma (HCC), although more than 70% of patients still do not respond to this first‐line treatment. Many new combination strategies are currently being explored, which drastically increases the need for preclinical models that would allow large‐scale testing of new immunotherapies and their combinations. We developed several in ovo (in the egg) human liver cancer models, based on human tumor xenografts of different liver cancer cell lines on the chicken embryo's chorioallantoic membrane. We characterized the angiogenesis, as well as the collagen accumulation and tumor immune microenvironment, and tested atezolizumab (anti‐PD‐L1) plus bevacizumab (anti‐VEGF) treatment. Our results show the involvement of chicken immune cells in tumor growth, reproducing a classical non‐inflamed “cold” as well as inflamed “hot” tumor status, depending on the in ovo liver cancer model. The treatment by atezolizumab and bevacizumab was highly efficient in the “hot” tumor model PLC/PRF/5 in ovo with the reduction of tumor size by 76% ( p ≤ .0001) compared with the control, whereas the efficacy was limited in the “cold” Hep3B in ovo tumor. The contribution of the anti‐PD‐L1 blockade to the anti‐tumoral effect in the PLC/PRF/5 in ovo model was demonstrated by the efficacy of atezolizumab monotherapy ( p = .0080, compared with the control). To conclude, our study provides a detailed characterization and rational arguments that could help to partially replace conventional laboratory animals with a more ethical model, suited to the current needs of preclinical research of new immunotherapies for liver cancer.

Développement d'un modèle in ovo innovant pour le criblage de molécules anti-inflammatoires : implications dans les thérapies anticancéreuses: L'inflammation joue un rôle clé dans les défenses immunitaires de l'organisme. Lorsqu'il détecte un signal nuisible, qu'il soit infectieux, traumatique ou dysfonctionnel, le système immunitaire déclenche une réaction biologique appelée réponse inflammatoire afin de neutraliser la menace et d'initier la réparation tissulaire. Toutefois, si l'inflammation n'est pas résolue, elle peut devenir nocive et provoquer davantage de dégâts aux tissus. Dans un contexte de cancer, il existe une relation complexe et néfaste entre les cellules tumorales et l'inflammation. En effet, la persistance de la tumeur favorise le dérèglement de la réponse inflammatoire, ce qui facilite l'oncogenèse et la progression de la tumeur. C'est ce que l'on observe dans le cancer du foie, par exemple, où la grande majorité des cas cliniques seraient liés à une maladie inflammatoire sous-jacente. Bien que les anti-inflammatoires se soient révélés efficaces contre le développement du cancer, leur toxicité à long terme empêche leur utilisation clinique. De nouvelles approches visant à limiter l'inflammation, telles que l'inhibition des protéines à bromodomaine et à domaine extra-terminal (BET), sont ainsi en cours de développement. Elles nécessitent ainsi des modèles in vivo pertinents pour évaluer leur efficacité et leur tolérance. Bien que les rongeurs soient à ce jour les modèles les plus utilisés pour étudier l'inflammation liée au cancer, ils présentent des limites au niveau de l'interface tumeur-immunité en plus des préoccupations éthiques. Un autre modèle in vivo, l'embryon de poulet et sa membrane chorioallantoïdienne (CAM), est néanmoins prometteur car il s'est non seulement avéré pertinent en immuno-oncologie, mais est aussi capable de déclencher des réponses inflammatoires similaires à l'humain.Dans ce contexte, nous avons établi un panel de quatre modèles de cancer du foie humain in ovo (dans l'œuf), basé sur la xénogreffe des lignées HepG2, Hep3B, HuH7 et PLC/PRF/5 sur la CAM du poulet. L'immunohistochimie et le séquençage de l'ARN ont été utilisés pour caractériser en détails l'angiogenèse, le dépôt de collagène et l'infiltration immunitaire. L'efficacité d'anti-inflammatoires classiques (dexaméthasone et ibuprofène) et innovants (inhibiteurs de BET) a été évaluée. Nous avons également testé in ovo l'efficacité antitumorale du traitement de première ligne dans le cancer du foie avancé, qui combine l'inhibiteur de point de contrôle immunitaire atezolizumab avec l'inhibiteur d'angiogenèse bevacizumab. Dans ce projet, le développement d'un modèle d'inflammation systémique in ovo, par l'administration chronique et aiguë de lipopolysaccharide sur la CAM, a également été exploré.Nos résultats ont révélé l'implication des cellules immunitaires et stromales de l'embryon de poulet dans la progression tumorale. Le panel validé de modèles de cancer du foie in ovo a notamment montré des tumeurs allant d'un état non inflammé ("froid") à inflammé ("chaud") selon la lignée choisie. Alors que Hep3B in ovo présentait un profil tumoral "froid" avec une faible immunogénicité, PLC/PRF/5 in ovo présentait au contraire une forte infiltration de lymphocytes T et une forte activité immunitaire, indiquant un profil tumoral "chaud". Cela a été illustré par la thérapie combinée d'atezolizumab/bevacizumab, où PLC/PRF/5 in ovo a montré une réduction significative de la croissance tumorale (76%), alors qu'une efficacité limitée a été observée avec Hep3B in ovo. D'autres expériences utilisant ce modèle in ovo de cancer "chaud" PLC/PRF/5 nous ont permis de tester in vivo l'effet d'un anti-inflammatoire non stéroïdien courant, l'ibuprofène, qui a significativement réduit la croissance tumorale (36%).Dans l'ensemble, notre travail a mis en évidence la pertinence de notre nouveau modèle de cancer inflammatoire in ovo dans l'évaluation de l'efficacité et de la toxicité de médicaments anti-inflammatoires et anti-cancéreux, permettant ainsi le criblage de nouvelles molécules.