The growing number of drug-resistant bacterial infections worldwide is driving renewed interest in phage therapy. Based on the use of a personalized cocktail composed of highly specific bacterial viruses, this therapy relies on a range of tests on agar media to determine the most active phage on a given bacterial target (phage susceptibility testing), or to isolate new lytic phages from an environmental sample (enrichment of phage banks). However, these culture-based techniques are still solely interpreted through direct visual detection of plaques. The main objective of this work is to investigate computer-assisted methods in order to ease and accelerate diagnosis in phage therapy but also to study phage plaque growth kinetics. For this purpose, we designed a custom wide-field lensless imaging device, which allows continuous monitoring over a very large area sensor (3.3 cm²). Here we report bacterial susceptibility toStaphylococcus aureusphage in 3 hr and estimation of infectious titer in 8 hr 20 min. These are much shorter time-to-results than the 12 to 24 hours traditionally needed, since naked eye observation and counting of phage plaques is still the most widely used technique for susceptibility testing prior to phage therapy. Moreover, the continuous monitoring of the samples enables the study of plaque growth kinetics, which enables a deeper understanding of the interaction between phage and bacteria. Finally, thanks to the 4.3 μm resolution, we detect phage-resistant bacterial microcolonies ofKlebsiella pneumoniaeinside the boundaries of phage plaques and thus show that our prototype is also a suitable device to track phage resistance. Lensless imaging is therefore an all-in-one method that could easily be implemented in cost-effective and compact devices in phage laboratories to help with phage therapy diagnosis.

In the context of bacteriophage (phage) therapy, there is an urgent need for a method permitting multiplexed, parallel phage susceptibility testing (PST) prior to the formulation of personalized phage cocktails for administration to patients suffering from antimicrobial-resistant bacterial infections. Methods based on surface plasmon resonance imaging (SPRi) and phase imaging were demonstrated as candidates for very rapid (<2 h) PST in the broth phase. Biosensing layers composed of arrays of phages 44AHJD, P68, and gh-1 were covalently immobilized on the surface of an SPRi prism and exposed to liquid culture of either Pseudomonas putida or methicillin-resistant Staphylococcus aureus (i.e., either the phages’ host or non-host bacteria). Monitoring of reflectivity reveals susceptibility of the challenge bacteria to the immobilized phage strains. Investigation of phase imaging of lytic replication of gh-1 demonstrates PST at the single-cell scale, without requiring phage immobilization. SPRi sensorgrams show that on-target regions increase in reflectivity more slowly, stabilizing later and to a lower level compared to off-target regions. Phage susceptibility can be revealed in as little as 30 min in both the SPRi and phase imaging methods.

Test optique de susceptibilité aux bactériophages par SPR (résonance plasmonique de surface): Dans cette thèse, une nouvelle modalité de test de susceptibilité aux bactériophages est proposée. Elle basée sur le suivi par surface plasmon resonance (SPR) des interactions entre des phages immobilisés et des souches bactériennes.La SPR est une technique ayant une sensibilité élevée dans le domaine de la profondeur de pénétration d'un champ évanescent (quelques centaines de nanomètres), ce qui nécessite l'immobilisation de sondes à une interface métal-analyte. La culture des phages nécessite la lyse des bactéries hôtes et la génération de grandes quantités de débris qui doivent être séparés des phages avant que des réactions chimiques entrainant leur immobilisation puissent être effectuées. Il convient de noter que cette tâche s'est avérée loin d'être triviale.Plusieurs méthodes ont été explorées pour la purification du phage gh-1, notamment l'ultrafiltration, l'ultracentrifugation à gradient de densité, la précipitation au PEG et la filtration à flux tangentiel. La comparaison a été effectuée sur la base de facteurs de mérite tels qu'un titre infectieux élevé, une faible agrégation des phages et l'élimination complète des contaminants du lysat de phage. Bien qu'aucune des méthodes mentionnées ne réponde simultanément à tous ces critères, leur combinaison a permis d'obtenir des suspensions de phages très pures et monodispersées tout en conservant leur infectivité.Une revue de la littérature sur l'immobilisation des phages a mené à la sélection d’un ensemble de stratégies qui ont été explorées pour l'immobilisation des phages sur des substrats en or. Après avoir comparé les résultats de différentes méthodes d'immobilisation, il a été démontré que l’utilisation d’une monocouche auto-assemblée thiolée produisait une couche dense et homogène de bactériophages infectieux sur des substrats à base d’or.Cette chimie d'immobilisation a ensuite été utilisée pour la micro-implantation de plusieurs phages sur la surface d'un capteur exploitant la SPR pour le suivi parallèle et multiplexé des interactions phage-hôte. Ce capteur SPR a mis en évidence des interactions spécifiques entre le phage 44AHJD et son hôte S. aureus, et entre le phage gh-1 et son hôte P. putida.Au cours de l'expérimentation, il a été remarqué que le titre des phages chutait de façon inattendue pendant la phase de stockage, ce qui entraînait parfois des échecs dans la culture des phages ou la fonctionnalisation des substrats. Une expérience à grande échelle, sur plusieurs semaines, a été menée pour étudier la cause profonde de ce phénomène. Des mesures complémentaires de comptage de plaques et une analyse de suivi des nanoparticules dans les suspensions de phages ont permis de mieux comprendre la perte multimodale du titre infectieux due à l'adsorption, à l'inactivation et à l'agrégation. Il a été confirmé que celle-ci varie en fonction du matériau constituant le récipient.Afin d'améliorer la sensibilité de la détection plasmonique, un nouveau capteur SPR a été développé. Il comporte un réseau d'électrodes interdigitées (IDE) intégré pour permettre le transport électrocinétique de masse allant de l'analyte vers la région de détection. Pour produire des réseaux d'électrodes interdigitées sur des prismes SPRi, une nouvelle méthode de prototypage rapide a été mise au point, basée sur l'ablation laser avec un appareil commercial de prototypage de circuits imprimés. L’efficacité du capteur SPR électrocinétique (EK-SPR) ainsi produit a été démontrée pour la détection de S. aureus, en exploitant l'affinité d'un réseau immobilisé de peptides antimicrobiens.