Charcot-Marie-Tooth disease 1 A (CMT1A) results from a duplication of the PMP22 gene in Schwann cells and a deficit of myelination in peripheral nerves. Patients with CMT1A have reduced nerve conduction velocity, muscle wasting, hand and foot deformations and foot drop walking. Here, we evaluate the safety and efficacy of recombinant adeno-associated viral vector serotype 9 (AAV2/9) expressing GFP and shRNAs targeting Pmp22 mRNA in animal models of Charcot-Marie-Tooth disease 1 A. Intra-nerve delivery of AAV2/9 in the sciatic nerve allowed widespread transgene expression in resident myelinating Schwann cells in mice, rats and non-human primates. A bilateral treatment restore expression levels of PMP22 comparable to wild-type conditions, resulting in increased myelination and prevention of motor and sensory impairments over a twelve-months period in a rat model of CMT1A. We observed limited off-target transduction and immune response using the intra-nerve delivery route. A combination of previously characterized human skin biomarkers is able to discriminate between treated and untreated animals, indicating their potential use as part of outcome measures.

Post-traumatic epilepsy (PTE) and neurocognitive deficits are devastating sequelae of head injuries that are common in adolescents. Investigating desperately needed treatments is hindered by the difficulties in inducing PTE in rodents and the lack of established immature rat models of pediatric PTE. Hemorrhage is a significant risk factor for PTE, but compared to humans, rats are less prone to bleeding because of their rapid blood coagulation system. In this study, we promoted bleeding in the controlled cortical impact (CCI) closed-head injury model with a 20 min pre-impact 600 IU/kg intraperitoneal heparin injection in postnatal day 35 (P35) periadolescent rats, given the preponderance of such injuries in this age group. Temporo-parietal CCI was performed post-heparin (HTBI group) or post-saline (TBI group). Controls were subjected to sham procedures following heparin or saline administration. Continuous long-term EEG monitoring was performed for 3 months post-CCI. Sensorimotor testing, the Morris water maze, and a modified active avoidance test were conducted between P80 and P100. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) levels and neuronal damage were also assessed. Compared to TBI rats, HTBI rats had persistently higher EEG spiking and increased hippocampal GFAP levels (p < 0.05). No sensorimotor deficits were detected in any group. Compared to controls, both HTBI and TBI groups had a long-term hippocampal neuronal loss (p < 0.05), as well as contextual and visuospatial learning deficits (p < 0.05). The hippocampal astrogliosis and EEG spiking detected in all rats subjected to our hemorrhage-promoting procedure suggest the emergence of hyperexcitable networks and pave the way to a periadolescent PTE rat model.

Charcot-Marie-Tooth disease 1A (CMT1A) results from a duplication of thePMP22gene leading to an excess of PMP22, a deficit of myelination and an instability of the myelin sheath in peripheral nerves. Patients present with reduced nerve conduction velocity, muscle waste, hand and foot deformations and foot drop walking problems. As gene silencing therapy has been shown to be effective in other monogenic neurological disorders, we evaluated the safety and efficacy of recombinant adeno-associated viral vector serotype 9 (AAV2/9)-based gene therapy for CMT1A. AAV2/9-mediated delivery of eGFP and shRNAs targeting PMP22 mRNA in the sciatic nerve allowed widespread gene expression in myelinating Schwann cells in mouse, rat and nonhuman primate. The treatment restored wild-type PMP22 level, increased myelination and prevented motor and sensory impairment over 12 months in a rat model of CMT1A. Intra-nerve injection limited off-target transduction and immune response to barely detectable levels. A combination of previously characterized human skin biomarkers successfully discriminated treated animals from their untreated littermate controls indicating their potential use as part of outcome measures in future clinical trials. Our results support intra nerve injection of AAV2/9 as an effective strategy for the treatment of CMT1A as well as other demyelinating CMT diseases.

Approche de thérapie génique sur des rats modèles de la maladie Charcot-Marie-Tooth de type 1A: La myéline est une gaine formée par l’enroulement de la membrane plasmique de la cellule de Schwann autour de l’axone dans le nerf périphérique. Lorsque cette gaine est détruite, on parle de démyélinisation, cela provoque de nombreuses maladies, dont les maladies de Charcot Marie Tooth (CMT) de type 1. Les maladies CMT sont héréditaires et atteignent le système nerveux périphérique. Les symptômes communs incluent : une faiblesse musculaire, une démarche maladroite, des troubles de l’équilibre et des pieds très cambrés ou très plats. Le type le plus fréquent est la forme autosomique dominante CMT1A.Une duplication du bras court du chromosome 17 contenant le gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) induit la CMT1A. La PMP22, une petite protéine exprimée par les cellules de Schwann, est donc en excès et entraine une démyélinisation. Il existe un modèle de rats transgéniques PMP22 (ou rats CMT1A) mimant cette pathologie humaine. Les rats CMT1A surexpriment la pmp22 de souris de façon hétérozygote. Jusqu’à présent, aucun remède n’existe pour les maladies CMT. Un des traitements envisageables est la thérapie génique. Le but de mon projet de thèse était d’étudier la validité et l'efficacité de la thérapie génique chez les rats CMT1A. La stratégie consiste à réduire la surexpression de la protéine PMP22 chez le rat CMT1A à l’aide d’ARNsh anti-PMP22. Pour ne pas être détruits par l’organisme et maintenir une expression longue, ces ARN sh-PMP22 sont transférés chez le rat grâce à des vecteurs viraux dérivés de virus adéno-associés, ou AAV (pour adeno-associated virus). Nous avons donc injecté un des différents sérotypes d'AAV,l'AAV9 exprimant les ARN sh-PMP22 de souris ainsi que la GFP comme marqueur des cellules infectées dans les nerfs sciatiques de rats CMT1A à l’âge de 6 jours ou 7 jours.Nous avons d’abord confirmé que les virus thérapeutiques infectaient une très large proportion de cellules de Schwann dans le nerf sciatique de rat CMT1A et ensuite que l’infection de ces cellules par les virus exprimant les ARN sh-PMP22 induisait une diminution significative de l’expression de la protéine PMP22. L'analyse du phénotype moteur des rats CMT1A traités avec les AAV9 exprimant les ARN sh-PMP22 montre que les rats CMT1A traités ne développent pas la maladie observée dans les contrôles. Également, les rats CMT1A présentent une hypoalgésie, un phénotype qui n’apparait pas dans les CMT1A traités avec les vecteurs thérapeutiques. Le traitement par thérapie génique empêche la réduction de la vitesse de conduction nerveuse observé dans les rats malades. Concernant la biodistribution des virus, 2,5 mois après le traitement, en dehors des nerfs sciatiques ou les virus ont été injectés, le virus était présent dans les muscles qui entourent le nerf et aussi dans quelques ganglion dorsaux. Pour la réponse immunitaire,les rats injectés, à seulement 2 exceptions près, n’ont pas développé de facteurs neutralisants anti-AAV9. Cette thérapie génique pourrait être utilisée dans les essais cliniques.Avant de passer aux études cliniques pour le traitement de la maladie CMT1A à l’aide d’AAV9 exprimant des ARN sh-PMP22 humain, la dose d’expression de ce ARN sh-PMP22 doit être très soigneusement déterminée car si la PMP22 est trop réduite, une autre maladie peut se développer, la neuropathie héréditaire avec hypersensibilité à la pression. Il est aussi important d’avoir un outil bien adapté qui permet d’évaluer l’efficacité du traitement. Aucun existant n’est assez fiable pour mesurer la myéline du nerf périphérique. Pour remédier à ce manque, nous avons testé la technique d'imagerie Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) en caractérisant avec succès les défauts de la myéline. Par conséquent, le CARS est une technique prometteuse permettant d’évaluer l’avancement des maladies de la myéline et l’efficacité de nouvelles thérapies pour les neuropathies périphériques démyélinisantes.