This study aimed to analyze clinical and regional factors influencing the distribution of actionable genetic alterations in a large consecutive series of colorectal carcinomas (CRCs). KRAS, NRAS and BRAF mutations, HER2 amplification and overexpression, and microsatellite instability (MSI) were tested in 8355 CRC samples. KRAS mutations were detected in 4137/8355 (49.5%) CRCs, with 3913 belonging to 10 common substitutions affecting codons 12/13/61/146, 174 being represented by 21 rare hot-spot variants, and 35 located outside the “hot” codons. KRAS Q61K substitution, which leads to the aberrant splicing of the gene, was accompanied by the second function-rescuing mutation in all 19 tumors analyzed. NRAS mutations were detected in 389/8355 (4.7%) CRCs (379 hot-spot and 10 non-hot-spot substitutions). BRAF mutations were identified in 556/8355 (6.7%) CRCs (codon 600: 510; codons 594–596: 38; codons 597–602: 8). The frequency of HER2 activation and MSI was 99/8008 (1.2%) and 432/8355 (5.2%), respectively. Some of the above events demonstrated differences in distribution according to patients’ age and gender. In contrast to other genetic alterations, BRAF mutation frequencies were subject to geographic variation, with a relatively low incidence in areas with an apparently warmer climate (83/1726 (4.8%) in Southern Russia and North Caucasus vs. 473/6629 (7.1%) in other regions of Russia, p = 0.0007). The simultaneous presence of two drug targets, BRAF mutation and MSI, was observed in 117/8355 cases (1.4%). Combined alterations of two driver genes were detected in 28/8355 (0.3%) tumors (KRAS/NRAS: 8; KRAS/BRAF: 4; KRAS/HER2: 12; NRAS/HER2: 4). This study demonstrates that a substantial portion of RAS alterations is represented by atypical mutations, KRAS Q61K substitution is always accompanied by the second gene-rescuing mutation, BRAF mutation frequency is a subject to geographical variations, and a small fraction of CRCs has simultaneous alterations in more than one driver gene.

This study aimed to conduct a comprehensive analysis of actionable gene rearrangements in tumors with microsatellite instability (MSI). The detection of translocations involved tests for 5′/3′-end expression imbalance, variant-specific PCR and RNA-based next generation sequencing (NGS). Gene fusions were detected in 58/471 (12.3%) colorectal carcinomas (CRCs), 4/69 (5.8%) gastric cancers (GCs) and 3/65 (4.6%) endometrial cancers (ECs) (ALK: 8; RET: 12; NTRK1: 24; NTRK2: 2; NTRK3: 19), while none of these alterations were observed in five cervical carcinomas (CCs), four pancreatic cancers (PanCs), three cholangiocarcinomas (ChCs) and two ovarian cancers (OCs). The highest frequency of gene rearrangements was seen in KRAS/NRAS/BRAF wild-type colorectal carcinomas (53/204 (26%)). Surprisingly, as many as 5/267 (1.9%) KRAS/NRAS/BRAF-mutated CRCs also carried tyrosine kinase fusions. Droplet digital PCR (ddPCR) analysis of the fraction of KRAS/NRAS/BRAF mutated gene copies in kinase-rearranged tumors indicated that there was simultaneous co-occurrence of two activating events in cancer cells, but not genetic mosaicism. CRC patients aged above 50 years had a strikingly higher frequency of translocations as compared to younger subjects (56/365 (15.3%) vs. 2/106 (1.9%), p = 0.002), and this difference was particularly pronounced for tumors with normal KRAS/NRAS/BRAF status (52/150 (34.7%) vs. 1/54 (1.9%), p = 0.001). There were no instances of MSI in 56 non-colorectal tumors carrying ALK, ROS1, RET or NTRK1 rearrangements. An analysis of tyrosine kinase gene translocations is particularly feasible in KRAS/NRAS/BRAF wild-type microsatellite-unstable CRCs, although other categories of tumors with MSI also demonstrate moderate occurrence of these events.

The technique 3’ rapid amplification of cDNA ends (3′ RACE) allows for detection of translocations with unknown gene partners located at the 3′ end of the chimeric transcript. We composed a 3′ RACE-based RNA sequencing panel for the analysis of FGFR1–4 gene rearrangements, detection of activating mutations located within FGFR1–4, IDH1/2, ERBB2 (HER2), KRAS, NRAS, BRAF, and PIK3CA genes, and measurement of the expression of ERBB2, PD-L1, and FGFR1–4 transcripts. This NGS panel was utilized for the molecular profiling of 168 biliary tract carcinomas (BTCs), including 83 intrahepatic cholangiocarcinomas (iCCAs), 44 extrahepatic cholangiocarcinomas (eCCAs), and 41 gallbladder adenocarcinomas (GBAs). The NGS failure rate was 3/168 (1.8%). iCCAs, but not other categories of BTCs, were characterized by frequent FGFR2 alterations (17/82, 20.7%) and IDH1/2 mutations (23/82, 28%). Other potentially druggable events included ERBB2 amplifications or mutations (7/165, 4.2% of all successfully analyzed BTCs) and BRAF p.V600E mutations (3/165, 1.8%). In addition to NGS, we analyzed microsatellite instability (MSI) using the standard five markers and revealed this event in 3/158 (1.9%) BTCs. There were no instances of ALK, ROS1, RET, and NTRK1–3 gene rearrangements or MET exon 14 skipping mutations. Parallel analysis of 47 iCCA samples with the Illumina TruSight Tumor 170 kit confirmed good performance of our NGS panel. In conclusion, targeted RNA sequencing coupled with the 3′ RACE technology is an efficient tool for the molecular diagnostics of BTCs.

Введение. Микросателлитная нестабильность (MSI) является следствием дефекта системы репарации неспаренных оснований ДНК и сопровождается накоплением множества мутаций в ткани опухоли. Этот феномен характерен для колоректальных опухолей, карцином желудка, рака эндометрия и некоторых других типов новообразований. MSI в опухолях часто сочетается с активацией сигнального пути MAPK, в частности с мутациями в генах KRAS, NRAS и BRAF. Недавние исследования показали, что в опухолях с микросателлитной нестабильностью также могут встречаться транслокации с участием тирозинкиназ ALK, ROS1, RET и NTRK1-3. Цель. Изучить частоту и спектр активирующих транслокаций тирозинкиназ при опухолях разных локализаций с микросателлитной нестабильностью. Материалы и методы. Статус MSI был определен для 27 408 новообразований. Выявление перестроек с участием генов ALK, ROS1, RET и NTRK1-3 в 1284 образцах MSI-позитивных опухолей осуществлялось при помощи тестов по определению несбалансированной экспрессии 5’/3’-концов гена, вариант-специфической ПЦР и высокопроизводительного секвенирования РНК (РНК-NGS). Результаты. Перестройки были обнаружены в 101/990 (10,2 %) случае колоректального рака и 1/108 (1 %) опухоли желудка (ALK: 11; RET: 25; NTRK1: 42; NTRK2: 2; NTRK3: 22), и не были выявлены при раке эндометрия (n = 157), шейки матки (n = 13), поджелудочной железы (n = 7), холангиокарциноме (n = 4) или раке яичника (n = 5). Самой высокой частота транслокаций оказалась среди KRAS/NRAS/BRAF-негативных колоректальных карцином с MSI 93/395 (23,5 %). Гораздо реже перестройки обнаруживались при раке толстой кишки с мутациями KRAS/NRAS/BRAF (8/597, 1,3 %). При раке толстой кишки присутствие транслокаций ассоциировалось с возрастом старше 50 лет ((97/795 (12,2 %) vs 3/195 (1,5 %), p = 0,0002)). Выводы. Транслокации с участием генов тирозинкиназ встречаются со значительной частотой при MSI-позитивном раке толстой кишки, в особенности при KRAS/NRAS/BRAF-негативных опухолях.

Введение. Микросателлитная нестабильность (Microsatellite Instability, MSI) является признаком дефицита системы репарации неспаренных оснований ДНК. Идентификация MSI в опухоли имеет значение для выбора лечебной тактики, так как MSI-позитивные новообразования отличаются высокой чувствительностью к терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа. Кроме этого, часть опухолей с MSI развивается в контексте наследственного заболевания — синдрома Линча. Цель. Анализ встречаемости и причин возникновения MSI в злокачественных новообразованиях предстательной железы у российских пациентов. Материалы и методы. Исследуемую группу составил 1201 случай рака предстательной железы (РПЖ). Для определения статуса MSI использовалась ПЦР-панель из 10 микросателлитных маркеров. В 10 из 13 MSI-позитивных РПЖ при помощи таргетного секвенирования нового поколения был выполнен анализ последовательности генов MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2. Результаты. MSI была обнаружена в 13 из 1136 (1,1 %) проанализированных образцов РПЖ. Большинство опухолей с MSI имели признаки агрессивного заболевания: 90 % MSI-позитивных РПЖ были диагностированы на 3–4-й стадии, и 75 % отличались низкой дифференцировкой. Мутации в генах MSH2 и MSH6, предположительно ставшие причиной MSI, были обнаружены в 5/10 (50 %) просеквенированных случаев. В одном из этих случаев была подтверждена наследственная природа патогенного варианта, подразумевающая диагноз синдрома Линча, и еще у трех пациентов в опухоли были обнаружены описанные при этом заболевании мутации. Их происхождение не удалось определить в связи с отсутствием образцов неопухолевой ДНК. Выводы. Встречаемость MSI при опухолях предстательной железы составляет около 1 %. От 10 до 40 % MSI-позитивных РПЖ могут возникать как проявление синдрома Линча.