In Poland, the first case of SARS-CoV-2 infection was confirmed in March 2020. Since then, many circulating virus lineages fueled rapid pandemic waves which inflicted a severe burden on the Polish healthcare system. Some of these lineages were associated with increased transmissibility and immune escape. Mutations in the viral spike protein, which is responsible for host cell recognition and serves as the primary target for neutralizing antibodies, are of particular importance. We investigated the molecular epidemiology of the SARS-CoV-2 clades circulating in Southern Poland from February 2021 to August 2021. The 921 whole-genome sequences were used for variant identification, spike mutation, and phylogenetic analyses. The Pango B.1.1.7 was the dominant variant (n = 730, 89.68%) from March 2021 to July 2021. In July 2021, the B.1.1.7 was displaced by the B.1.617.2 lineage with 66.66% in July 2021 and 92.3% in August 2021 frequencies, respectively. Moreover, our results were compared with the sequencing available on the GISAID platform for other regions of Poland, the Czech Republic, and Slovakia. The analysis showed that the dominant variant in the analyzed period was B.1.1.7 in all countries and Southern Poland (Silesia). Interestingly, B.1.1.7 was replaced by B.1.617.2 earlier in Southern Poland than in the rest of the country. Moreover, in the Czech Republic and Slovakia, AY lineages were predominant at that time, contrary to the Silesia region.

Purpose Peptide nucleic acids (PNAs) are synthetic molecules with a unique N-(2-aminoethyl)glycine backbone that offer increased stability and resistance to degradation compared to DNA/RNA. The ability of these compounds to bind complementarily to DNA or RNA, forming various stable hybrids, makes them hold potential for applications in gene therapy and molecular diagnostics. Nonetheless, the poor ability of PNAs to cross cell membranes required the use of delivery systems. This study aimed to establish and optimize non-covalent PNA, and cell penetrating peptide (CPP) complexes and evaluate their efficiency thereby establishing a tool for future targeted therapeutic applications. Methods This study utilized three different CPPs to deliver PNA, demonstrating successful cell membrane crossing in vitro. We optimized PNA and CPP concentrations and evaluated the efficiency of the CPPs. The CPPs used were TP10, Tat, and TD2.2. The PNAs and CPPs were complexed via non-covalent binding. Each CPP molecule was designed to contain a nuclear localization signal (NLS) fragment at their 3’ end to enhance nuclear delivery. Research methods included cellular fluorescence measurement, high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis, western blot, and cell viability assessment using the MTT assay. Results We optimized PNA and CPP concentrations and evaluated the efficiency of the CPPs, finding that TP10 was more effective in comparison with TD2.2 and Tat. This approach effectively delivered PNAs to their specific location. Conclusion The obtained results demonstrated the effective delivery of PNAs combined with CPPs to their specific cellular location thus suggesting that this may pose a promising strategy for analogous targeted molecular applications.

Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) is a protein that plays a key role in the metabolism of low-density lipoprotein (LDL) cholesterol. The gain-of-function mutations of the PCSK9 gene lead to a reduced number of surface LDL receptors by binding to them, eventually leading to endosomal degradation. This, in turn, is the culprit of hypercholesterolemia, resulting in accelerated atherogenesis. The modern treatment for hypercholesterolemia encompasses the use of biological drugs against PCSK9, like monoclonal antibodies and gene expression modulators such as inclisiran—a short, interfering RNA (siRNA). Peptide nucleic acid (PNA) is a synthetic analog of nucleic acid that possesses a synthetic peptide skeleton instead of a phosphate–sugar one. This different structure determines the unique properties of PNA (e.g., neutral charge, enzymatic resistance, and an enormously high affinity with complementary DNA and RNA). Therefore, it might be possible to use PNA against PCSK9 in the treatment of hypercholesterolemia. We sought to explore the impact of three selected PNA oligomers on PCSK9 gene expression. Using a cell-free transcription/translation system, we showed that one of the tested PNA strands was able to reduce the PCSK9 gene expression down to 74%, 64%, and 68%, as measured by RT–real-time PCR, Western blot, and HPLC, respectively. This preliminary study shows the high applicability of a cell-free enzymatic environment as an efficient tool in the initial evaluation of biologically active PNA molecules in the field of hypercholesterolemia research. This cell-free approach allows for the omission of the hurdles associated with transmembrane PNA transportation at the early stage of PNA selection.

Przedmiot badań Limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (komórki CAR-T, ang. Chimeric antigen receptor T cell) stanowią produkty lecznicze terapii zaawansowanej (ATMP – ang. Advanced Therapy Medicinal Products), których jakość jest bezpośrednio zależna od przebiegu procesu wytwarzania. W przypadku produktów autologicznych krytyczne znaczenie mają parametry procesu (CPP – ang. Critical Process Parameters), wpływające na uzyskanie wymaganej jakości produktu (CQA – ang. Critical Quality Attributes), takich jak skuteczność transferu genów, skład populacji komórkowej oraz aktywność biologiczna. Jednoczesne ukierunkowanie limfocytów T przeciwko antygenom BCMA (ang. B-cell maturation antigen) i GPRC5D (ang. G protein-coupled receptor class C group 5 member D) może zwiększać skuteczność terapii szpiczaka mnogiego poprzez ograniczenie zjawiska ucieczki antygenowej, jednak wymaga opracowania powtarzalnego procesu umożliwiającego efektywną kotransdukcję dwoma wektorami lentiwirusowymi. Cel badań Celem pracy była ocena możliwości opracowania oraz walidacji technologicznej zamkniętego, zautomatyzowanego procesu wytwarzania podwójnie ukierunkowanego produktu CAR-T zgodnego z wymaganiami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP – ang. Good Manufacturing Practice), ze szczególnym uwzględnieniem wpływu procesu na kluczowe parametry jakości gotowego produktu. Materiał i metody Proces obejmujący aktywację limfocytów T, jednoczesną kotransdukcję dwoma wektorami lentiwirusowymi oraz 14-dniową ekspansję komórek prowadzono na platformie CliniMACS Prodigy w systemie zamkniętym. Obecność obu transgenów potwierdzono metodami molekularnymi. Ocenie poddano wydajność transferu genów na podstawie ekspresji GFP, zmiany immunofenotypu komórek, aktywność cytotoksyczną wobec linii szpiczaka mnogiego NCI-H929 przy różnych stosunkach efektor:cel (E:T) wynoszących 1:1, 1:2 i 1:5 oraz profil wydzielanych cytokin jako wskaźnik funkcjonalności produktu. Wyniki Proces umożliwił uzyskanie produktu CAR-T spełniającego założone kryteria funkcjonalne. Odsetek komórek GFP-dodatnich osiągnął 30,7% w 14. dniu hodowli, a udział limfocytów CD8⁺ zwiększył się z 22,4% do 50,8%, wskazując na skuteczną ekspansję populacji efektorowej. Po 48 godzinach kokultury z komórkami NCI-H929 zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych wyniosło odpowiednio 94,12%, 76,14% oraz 46,39% dla stosunków E:T 1:1, 1:2 i 1:5. Analiza wydzielanych cytokin wykazała dominację odpowiedzi typu Th1, potwierdzając zachowanie aktywności efektorowej komórek po zakończeniu procesu wytwarzania. Wnioski Opracowany proces potwierdza możliwość wytwarzania podwójnie ukierunkowanego produktu CAR-T w zamkniętym, zautomatyzowanym środowisku zgodnym z GMP, przy zachowaniu istotnych parametrów jakości produktu. Jednocześnie niższa wydajność transferu genów względem warunków laboratoryjnych wskazuje, że skalowanie procesu do standardu GMP wymaga odrębnej optymalizacji oraz walidacji krytycznych parametrów procesu zgodnie z założeniami podejścia Quality by Design. Uzyskane wyniki potwierdzają, że kontrola procesu wytwarzania stanowi kluczowy element zapewnienia jakości, bezpieczeństwa i powtarzalności produktów CAR-T przeznaczonych do zastosowań klinicznych.

Efficient and reproducible lentiviral vector production and T-cell transduction remain important technical challenges in CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-cell) cell manufacturing. In this study, we optimized HEK293T transfection and primary T-cell transduction parameters for lentiviral CAR constructs targeting BCMA (B-cell maturation antigen) and GPRC5D (G-protein coupled receptor family C group 5 member D). Lipofectamine 3000 and TurboFectin 8.0 were compared across different seeding densities and reagent-to-DNA ratios, with vector yields quantified by qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) and p24 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Lipofectamine 3000 consistently generated higher viral titers and transduction efficiencies, as reflected by a greater proportion of GFP-positive (Green Fluorescent Protein) cells than TurboFectin 8.0, reaching peak titers of 9.65 × 10⁸ copies/mL for the anti-GPRC5D and 5.33 × 10⁸ copies/mL for the anti-BCMA vectors. Under optimized conditions, transduction efficiencies reached 43.8% GFP⁺ cells for BCMA-CAR and approximately 13–14% GFP-positive transduced cells for the GPRC5D construct within the tested TU/mL range. Co-transduction experiments yielded approximately 62–66% GFP⁺ cells with detectable BCMA-binding and presumptive GPRC5D-CAR-expressing subpopulations identified based on GFP reporter expression. Immunophenotypic analysis demonstrated a relatively stable CD4/CD8 distribution (~65/35), enrichment of effector memory CD8⁺ cells, and expression of activation-associated markers. Collectively, these findings describe an optimized lentiviral transfection and transduction workflow that may support the further development of dual-targeting BCMA/GPRC5D CAR-T manufacturing strategies in research and early translational settings.

Przedmiot badań Choroby sercowo-naczyniowe o podłożu miażdżycowym pozostają główną przyczyną śmiertelności na świecie, a hipercholesterolemia jest ich kluczowym, modyfikowalnym czynnikiem ryzyka. Białko PCSK9 odgrywa krytyczną, negatywną rolę w regulacji homeostazy cholesterolu poprzez indukowanie wewnątrzkomórkowej, lizosomalnej degradacji receptorów dla lipoprotein o niskiej gęstości na powierzchni hepatocytów. W obliczu ograniczeń tradycyjnej farmakoterapii, takich jak powszechna nietolerancja statyn, brak odpowiedniej odpowiedzi na ezetymib oraz zjawisko utrzymującego się ryzyka resztkowego, rozwój innowacyjnych strategii terapeutycznych stał się priorytetem. Celowanie w szlak PCSK9 za pomocą leków opartych na kwasach nukleinowych stanowi obecnie jeden z najbardziej obiecujących i dynamicznie rozwijających się obszarów współczesnej kardiologii molekularnej oraz farmakogenomiki. Cel badań Głównym celem niniejszej pracy przeglądowej jest wszechstronna analiza, usystematyzowanie i krytyczna ocena ewolucji metod molekularnego celowania w szlak PCSK9 z wykorzystaniem kwasów nukleinowych. Praca ma na celu zestawienie klinicznie zatwierdzonych technologii interferencji RNA i oligonukleotydów antysensownych z nowatorskimi podejściami opartymi na edycji genomu (takimi jak system CRISPR/Cas9 oraz edytory zasad – base editing) i modyfikacjach epigenetycznych. Szczególnym celem jest wykazanie unikalnego potencjału farmakologicznego i biologicznego peptydowych kwasów nukleinowych jako innowacyjnej, wysoce specyficznej alternatywy dla klasycznych analogów kwasów nukleinowych w precyzyjnej terapii hipercholesterolemii. Materiał i metody Niniejsza praca stanowi przegląd narracyjny (narrative review) literatury dotyczącej terapii celowanych w PCSK9. Wyszukiwanie przeprowadzono w bazach PubMed/MEDLINE, Scopus, Web of Science i Cochrane Library w okresie od stycznia do czerwca 2026 r. Analizie poddano kluczowe prace oryginalne, badania kliniczne i metaanalizy z ostatniej dekady. Strategia wyszukiwania obejmowała słowa kluczowe (m.in. „PCSK9”, „terapie kwasami nukleinowymi”, „CRISPR/Cas9”, „PNA”), przy czym z przeglądu wykluczono opisy przypadków, abstrakty konferencyjne oraz artykuły popularnonaukowe. Wykorzystanie narzędzi sztucznej inteligencji Ryciny [2–4] zostały przygotowane przez autorów z wykorzystaniem narzędzia sztucznej inteligencji ChatGPT, model GPT-5.5 Thinking, OpenAI, w celu opracowania schematów ilustracyjnych. Autorzy przygotowali założenia merytoryczne oraz treść rycin, a następnie zweryfikowali i zmodyfikowali wygenerowane obrazy pod kątem poprawności naukowej. Ryciny mają charakter schematyczny. Autorzy ponoszą pełną odpowiedzialność za końcową treść rycin. Wyniki Analiza zgromadzonego piśmiennictwa wskazuje na wyraźną ewolucję strategii terapeutycznych. Klinicznie zatwierdzone metody oparte na RNA pozwalają na skuteczną, odwracalną redukcję poziomu białka PCSK9 przy korzystnym profilu bezpieczeństwa, jednak wymagają regularnego podawania dawek podtrzymujących. Z kolei technologie edycji genów (CRISPR/Cas9) wykazują w badaniach przedklinicznych potencjał do trwałej dezaktywacji genu PCSK9. Ich rozwój jest jednak spowalniany przez obawy dotyczące nieodwracalności wprowadzonych zmian, ryzyka mutagenezy nieswoistej (off-target) oraz immunogenności. Na tym tle interesującą, eksperymentalną alternatywę stanowią peptydowe kwasy nukleinowe (PNA). Dzięki pseudopeptydowej budowie wykazują one odporność na degradację enzymatyczną i wysokie powinowactwo do sekwencji docelowych, hamując ekspresję PCSK9 na poziomie transkrypcji i translacji. Niemniej, potencjał translacyjny PNA pozostaje ograniczony przez wyzwania w transporcie komórkowym, ryzyko niespecyficznych interakcji oraz możliwość cytotoksyczności wynikającej z ich wewnątrzkomórkowej akumulacji. Wnioski Postęp w dziedzinie terapii opartych na kwasach nukleinowych znacząco poszerza perspektywy leczenia chorób układu krążenia. Podczas gdy zatwierdzone już metody oparte na RNA oferują skuteczną, lecz przemijającą kontrolę profilu lipidowego, technologie edycji genów oraz inhibitory PNA wykazują potencjał do długotrwałej redukcji poziomu cholesterolu LDL. Choć te innowacyjne rozwiązania dają nadzieję na poprawę problemu braku współpracy ze strony pacjenta (ang. compliance) w przewlekłej farmakoterapii, należy podkreślić ich wczesny, badawczy etap rozwoju. Perspektywa wykorzystania unikalnych właściwości PNA i narzędzi edycji genomu w medycynie precyzyjnej będzie zależeć od rozwiązania kluczowych barier translacyjnych, w tym optymalizacji wewnątrzkomórkowego dostarczania leków, a także wyeliminowania ryzyka cytotoksyczności i długoterminowych efektów nieswoistych (off-target).